次氯酸漱口水、口腔细菌和金黄色葡萄球菌

最后有 83 人被招募到本研究中。 共有 53 名经牙周病医生诊断为牙周病的患者，他们被随机分配到仅漱口水组（26 名患者）或漱口水加牙周牙线器组（27 名患者）。 有 30 名对照被招募到本研究中。 为了测定口腔细菌数量，应用实时聚合酶链反应和连续稀释的金黄色葡萄球菌纯菌株创建标准化生长曲线，用于估计唾液中的口腔细菌数量。 在干预之前，参与者被要求用 5 毫升水漱口以清除口腔中的食物残渣和其他残留物。 干预要求参与者用 15 毫升漱口水或清水在口腔中冲洗 5 分钟。

参与者被问及他们的健康史和牙齿清洁工具的使用情况。 参与者接受了相关的口腔健康检查，并记录了他们的口腔健康指标。 本研究中用于干预的漱口水是 15 mL 市售 La Chlogen 漱口水（中华民国专利号 M616466），持续 5 分钟。 漱口水的主要成分是低浓度高纯度次氯酸（100 ppm）。 HOCl 溶液还可与 La Chlogen 牙周牙线器（中华民国专利号 M590033）结合使用。 指示对照用纯水(15ml)漱口5分钟。 每个参与者首先进行预测试，在收集参与者的唾液样本后，测量他们的口腔细菌总数 (TOBC)。 此后，每个参与者用指定的液体（漱口水、漱口水加牙周牙线或水）漱口，不要随地吐痰。 5 分钟后，参与者吐出液体，收集这些唾液样本并进行测试以确定 TOBC。

每个参与者都接受了两次唾液样本采集：前测和后测。 在收集唾液之前，参与者用 5 毫升水冲洗。 在此之后，参与者被要求在最长 3 分钟的时间内吐痰到 50 毫升无菌离心管（台湾创新生物科技有限公司）中，以收集未受刺激的全唾液。 采集到的标本立即放入便携式冰盒中保存，当天送回实验室进行细菌DNA提取。 在细菌基因组 DNA 提取过程之前，还记录了每个样本的唾液体积和重量。

TOBC 分析：提取细菌基因组 DNA 后，使用实时聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术对唾液样本中的口腔细菌总数进行定量。 唾液样本以 2500 rpm 的转速离心 5 分钟。 用 300µl 溶菌酶溶液 (2.5 mg/mL) 悬浮沉淀。 混合均匀后，将混合物转移至1.5mL eppendorf管中，冰上放置1小时。 此后，依次向每管中加入10% SDS（20µL）、0.5M EDTA（80µL）和20mg/mL蛋白酶K（10µL）；将每管内容物混合均匀，放入 55°C 烘箱中过夜。 接下来，将等体积的 10M NH4OAC 添加到混合物中。 将混合物置于冰上 5 分钟并以 13,000 rpm 离心 10 分钟。 将所得上清液置于 1.5 mL 离心管中。 向所得混合物中等体积加入异丙醇，并将混合物在-20℃下储存过夜或-80℃下储存1小时。 13,000rpm离心10分钟后，除去沉淀物上清液，加入75%酒精（500μL）静置5分钟，13,000rpm离心10分钟。 然后除去醇。 接下来，将 100% 酒精 (500µL) 添加到沉淀中。 将混合物静置 5 分钟，随后以 13,000 rpm 离心 10 分钟。 最后倒掉管内的酒精，将离心管倒置，让残留的酒精挥发。 最后，用适量无菌水溶解DNA沉淀，放入55℃烘箱中5分钟，-20℃保存。 通常，OD260/OD280 比值为 1.4 或更高的 DNA 标本。 回收的 DNA 的浓度是根据 OD260 = 1.00 时 50 µg/mL 的浓度计算的，确定该浓度适用于估算每个样品在 DNA 定量后的 TOBC。 金黄色葡萄球菌 (ATCC 29213) 用作细菌生长曲线估计中的参考菌株。 过夜培养后，将菌液连续稀释 5 倍，得到不同浓度金黄色葡萄球菌的标本。 每个样品总共取 10 µL 并涂在琼脂培养基上，以达到 2.5 × 103 至 3.9 × 107 CFU/mL 的浓度。 取 1 mL 体积的每种不同细菌浓度用于细菌 DNA 提取。 提取的细菌基因组 DNA 在进行 RT-PCR 测试之前，在-80°C 下冷冻保存。 在 RT-PCR 测试之前，测量细菌基因组 DNA 浓度。 RT-PCR测试主要检测16S rRNA，并使用StepOnePlus系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）建立金黄色葡萄球菌浓度的标准曲线。 使用的正向引物和反向引物的序列分别为 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' 和 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'。 16 选定的常见细菌物种正向和反向引物对的覆盖率分别为 94.9% 和 92.8%。 16 PCR 总体积为 25 uL，包括 5.5 µL ddH2O、1.0 µL 5-µM 预引物、1.0 µL 5-µM 反向引物、12.5 µL SYBR 溶液和 5.0 µL（0.25 µg）DNA。 RT-PCR反应条件为：94℃，10分钟；随后是 95°C 45 秒、58°C 40 秒和 72°C 60 秒的 35 个循环；然后进行一个 72°C 7 分钟的循环。 来自标准曲线和 RT-PCR 结果的回归方程用于计算每个唾液样本中的细菌浓度。 对每个样品进行两次 RT-PCR 测定，阈值的变异系数在 2% 和 12% 之间变化。 人血DNA用作阴性对照组。

漱口液的抑菌活性：将纯培养的金黄色葡萄球菌作为标准菌株接种于含有1.5%（g/L）卢里亚肉汤琼脂的培养板（直径10cm）上培养过夜。 挑取单个菌落置于装有LB营养液的锥形瓶中，摇匀，复培养过夜，所得溶液经系列稀释后涂于平板上，计算单位体积的菌数。 最后，使用Cell Counting Kit 8（CCK-8，Engreen Biosystem）商业试剂评估漱口水的抗菌效果。 每个实验一式两份进行。 将含有不同菌落形成单位（0、10、100、1000、10000、100000和1000000）金黄色葡萄球菌的溶液以2000rpm离心5分钟以浓缩细菌；除去液体后，加入180μL新鲜培养基，使菌体悬浮于培养基中。 将细菌溶液转移到96孔板中。 为了评估漱口水的抗菌效果，将 20 µL 漱口水添加到细菌溶液的混合物中。 混合物在 37°C 下孵育 2 小时。 最后加入10 µL CCK-8试剂，混匀。 将所得混合物在 37°C 下孵育 2 小时，并使用 ELISA 读取器测量 450 nm 处的吸光度。 可以建立标准生长曲线来估计混合物中的细菌数量和细菌的存活率，然后将其与标准曲线进行比较。

统计分析：数据采集、核对完成后，将最终调试好的文件传输到装有统计软件的计算机上进行统计分析。 使用的描述性统计包括频率分布表、百分比、均值和标准差。 在TOBC分析中，除了描述性统计外，还进行了t检验、卡方检验和线性回归分析，以评估和比较干预期后参与者唾液细菌计数的变化。 考虑到样本量小和TOBC的分布，采用非参数统计方法进行分析。 Wilcoxon 秩和检验用于识别干预组和对照组数值数据的差异，Wilcoxon 符号秩和检验用于识别基线和干预后数值数据的变化，Kruskal- Wallis 检验和事后 Tukey 检验用于识别三组或更多组的数值​​数据差异。