ヒトてんかん脳における抑制性神経伝達の機能的研究。
人間の脳から切除された神経組織における抑制性および興奮性神経伝達の機能的研究：新しい分子メカニズムの理解と薬剤耐性てんかんを治療するための新しい治療標的の発見。
調査の概要
詳細な説明
プロジェクトの目的は次の 3 つです。
- サブユニット組成を特定するために、選択的な負および正のアロステリックモジュレーターの存在下で、特定のアゴニストであるムシモールによって誘発される巨視的な GABA-A 媒介電流の特徴付け。
- 薬理学的ツールを使用して、海馬および皮質錐体ニューロンから記録されたシナプス GABA-A 媒介電流の機能的特徴付け。
- 目的 1) および 2) に関する知識を習得した後、脳に存在する他の神経伝達物質システム: コリン作動性システム、セロトニン作動性システム、そしてドーパミン作動系。
実験計画：
AIM1 WP1.1: apha1/alpha2 サブユニット GABA-A に選択的なジアゼパムやニトラゼパムなどのポジティブ アロステリック モジュレーターでスライスを灌流する、ムシモールによって誘発された錐体ニューロンおよび介在ニューロンからの全細胞 GABA-A 媒介電流のパッチクランプ記録α4/α6サブユニットに選択的な受容体またはフェノバルビタールを含むGABA-A受容体を含む。
WP 1.2: apha1/alpha2 サブユニット GABA-A 含有受容体または L655 に選択的な BetaCCT などの負のアロステリック モジュレーターでスライスを灌流する、ムシモールによって誘発される錐体ニューロンおよび介在ニューロンからの全細胞 GABA-A 媒介電流のパッチクランプ記録、７０８およびフロセミドは、受容体を含むアルファ４／アルファ６サブユニットＧＡＢＡ－Ａに対して選択的である。
AIM2 WP2.1: 介在ニューロンおよび錐体細胞からの自発的および誘発された GABA-A シナプス電流のパッチクランプ記録と、目的 1 と同じ薬理学的ツールによるそれらの変調、WP2.2: 自発的および誘発されたグルタミン酸作動性シナプスのパッチクランプ記録介在ニューロンおよび錐体細胞からの電流と、GABA 正および負のアロステリックモジュレーターによるそれらの変調。
AIM3 WP 3.1:錐体ニューロンの自発電流を記録することによる GABA 放出の増加、アロステリック モジュレーターによるコリン作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性受容体の調節。
方法論と統計分析:
脳神経外科的アプローチ中、1 立方センチメートルの総生検組織が ex-vivo 実験に使用されます。横方向の新皮質または海馬スライス (厚さ 350 μm) は、ビブラトーム (ライカ VT 1000S ) 外科的切除の直後。 スライスは、酸素化された ACSF と室温でスライス インキュベーション チャンバーに配置され、スライスの準備後 1-24 時間以内に記録室に転送されます。 全細胞パッチクランプ記録は、錐体細胞または介在ニューロンで 22 ～ 25 °C で行われます。
興奮性および抑制性の自発性またはミニチュア シナプス後電流の両方が、Multiclamp 700B アンプ (Axon Instruments、Foster City、CA、USA)、-70 mV 保持電位、TTX、1 microM、CNQX、20microM および ( AP5、ナトリウム電流、AMPA、カイニン酸および NMDA 受容体をそれぞれブロックするための 40microM、または必要に応じて GABA -A および -B 受容体をブロックするためのビククリン (20 microM) および CGP55845 (50nM) の存在下。 パッチ ピペットは、140 mM KCl、10 mM HEPES、0.5 mM EGTA、および 2 mM Mg-ATP (pH 7.35、KOH を含む) を含む細胞内溶液で満たされます。 実験中、5 分ごとに入力抵抗と直列抵抗を監視し、10% を超える変化がセルをさらなる分析から除外します。 GABA-A受容体アゴニストまたはアンタゴニストは、10分間の浴溶液中での灌流によって細胞に投与されます。
ケミカルとソリューション。 ACSF の組成は次のとおりです: 125 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4、1 mM MgCl2、26 mM NaHCO3、10 mM グルコース、0.1 mM Na-ピルビン酸 (pH 7.35)。 グリセロールベースの ACSF 溶液には、250 mM グリセロール、2.5 mM KCl、2.4 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2、1.2 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、11 mM グルコース、および 0.1 mM Na-ピルビン酸 (pH 7.35) が含まれます。
データ分析と統計。 電気生理学的パラメーターの分析は、スライド テンプレートに基づく検出アルゴリズムを使用して、Clampfit 10 ソフトウェア (Axon Instruments、Foster City、CA、USA) で実行されます。 電流を特徴付けるために、次のものが使用されます。 ii) 減衰時間 (ピーク電流の 90 ～ 10% の減少に必要な時間として); iii) 単一のシナプス イベントの平均電荷、Q (電流の時間積分として測定)。 vi) 振幅と v) シナプス イベントの頻度。 グループ間の統計的比較は、One Way ANOVA 検定 (Shapiro-Wilk 正規性検定、等分散検定) で行い、Holm-Sidak 法によるすべてのペアワイズ多重比較を行いました。 実行されたすべてのテストの検出力は > 0.8 (アルファ = 0.05) でした。 P <0.05が有意と見なされました。 正規性検定または等分散検定に失敗した場合、ランクに関するクラスカル・ワリス一元配置分散分析が使用され、ペアごとの比較にはダンの方法が使用されました。
参加者数 (n 患者 = n 細胞) を計算するために、「Camussi et al., 1995 の反復法」を使用します。 n は人間のニューロンの数であるという関係に従います: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, ここで、sigma はサンプリング分散 (s^2) の推定値で置換する必要があります, alpha=0.05, z*alpha=-2、D は処理間の差です。 このことを考慮すると、前述の WPI ごとに 12 人の患者が必要になります。 5年間で合計60人の患者がこの研究に参加します。
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研究の種類
入学 (予想される)
連絡先と場所
研究連絡先
- 名前：katiuscia Martinello, Biology
- 電話番号：+39 0865915218
- メール：katiuscia.martinello@neuromed.it
研究場所
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Isernia
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Pozzilli、Isernia、イタリア、86090
- 募集
- IRCCS INM Neuromed
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コンタクト：
- katiuscia Martinello, Biology
- 電話番号：+39 0865-915218
- メール：Katiuscia.martinello@neuromed.it
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主任研究者：
- katiuscia Martinello, Biology, PhD
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副調査官：
- Patrizia Ratano, Biology, PhD
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副調査官：
- Fucile Sergio, Physics,PhD
-
副調査官：
- Limatola Cristina, Biology,PhD
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副調査官：
- Esposito Vincenzo, MD, NCH
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参加基準
適格基準
就学可能な年齢
- 子
- 大人
- 高齢者
健康ボランティアの受け入れ
受講資格のある性別
サンプリング方法
調査対象母集団
説明
包含基準:
薬剤抵抗性側頭葉てんかん患者。
除外基準:
- 脳卒中、虚血、海綿状血管腫、または髄膜腫の増殖によって引き起こされる側頭葉てんかんに罹患している患者。
研究計画
研究はどのように設計されていますか？
デザインの詳細
- 観測モデル：ケースのみ
- 時間の展望：回顧
コホートと介入
グループ/コホート |
介入・治療 |
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薬剤耐性てんかん患者
てんかん病巣の神経外科的切除を受ける薬剤耐性てんかんのすべての患者。
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生検から得られた組織切片での生体外実験
他の名前：
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この研究は何を測定していますか？
主要な結果の測定
結果測定 |
メジャーの説明 |
時間枠 |
|---|---|---|
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巨視的電流を調節するGABA-A受容体の組成
時間枠：24ヶ月
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WP1.1- 12 人の患者から得られた組織の切片 治療 : ジアゼパムまたはニトラゼパムとフェノバルビタール WP 1.2:- 12 人の患者から得られた組織の切片 治療: BetaCCT および L655,708 またはフロセミド . |
24ヶ月
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GABA-A受容体PAMおよびNAMによるシナプス伝達の調節
時間枠：24
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WP2.1 12 人の患者から得られた組織切片 治療: ジアゼパム、フェノバルビタール、BetcCCt、およびフロセミド、抑制性シナプス伝達に対する効果 WP2.2: 12 人の患者から得られた組織切片 治療: ジアゼパム、フェノバルビタール、BetcCCt、およびフロセミド、興奮性シナプス伝達に対する効果 |
24
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コリン作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性 PAM による抑制性シナプス伝達の調節。
時間枠：12
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WP 3.1 12 人の患者から得られた組織切片 主要アウトカム 1 および 2 で得られた結果に基づく 治療: PNU dFBr、mCPGB、または L-ドーパ、抑制性神経伝達に対する効果。 |
12
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協力者と研究者
スポンサー
捜査官
- 主任研究者：katiuscia Martinello, Biology、Neuromed IRCCS
研究記録日
主要日程の研究
研究開始 (実際)
一次修了 (予想される)
研究の完了 (予想される)
試験登録日
最初に提出
QC基準を満たした最初の提出物
最初の投稿 (実際)
学習記録の更新
投稿された最後の更新 (実際)
QC基準を満たした最後の更新が送信されました
最終確認日
詳しくは
この情報は、Web サイト clinicaltrials.gov から変更なしで直接取得したものです。研究の詳細を変更、削除、または更新するリクエストがある場合は、register@clinicaltrials.gov。 までご連絡ください。 clinicaltrials.gov に変更が加えられるとすぐに、ウェブサイトでも自動的に更新されます。