Estudio funcional de la neurotransmisión inhibitoria en el cerebro epiléptico humano.

El proyecto presenta 3 objetivos:

1. Caracterización de corrientes macroscópicas mediadas por GABA-A evocadas por el agonista específico, muscimol, en presencia de moduladores alostéricos positivos y negativos selectivos para identificar la composición de la subunidad.
2. Caracterización funcional de corrientes sinápticas mediadas por GABA-A registradas en neuronas hipocampales y piramidales corticales mediante el uso de herramientas farmacológicas.
3. Tras el conocimiento adquirido de los objetivos 1) y 2), promoción del aumento del tono inhibitorio en el tejido epiléptico, potenciando la liberación de GABA desde las interneuronas hacia las células principales, mediante la estimulación de otros sistemas de neurotransmisores presentes en el cerebro: sistema colinérgico, sistema serotoninérgico, y sistema dopaminérgico.

Diseño experimental:

AIM1 WP1.1: grabaciones de pinzamiento de parche de corrientes mediadas por GABA-A de células enteras de piramidales e interneuronas evocadas por muscimol, perfundiendo los cortes con moduladores alostéricos positivos como diazepam o nitrazepam, que son selectivos para las subunidades apha1/alpha2 GABA-A que contienen receptores o fenobarbital selectivo para las subunidades alfa4/alfa6 GABA-A que contienen receptores.

WP 1.2: Grabaciones patch-clamp de corrientes mediadas por GABA-A de células enteras de piramidales e interneuronas evocadas por muscimol, perfundiendo los cortes con moduladores alostéricos negativos como BetaCCT, que es selectivo para las subunidades apha1/alpha2 que contienen GABA-A o L655 ,708 y furosemida que son selectivos para los receptores que contienen subunidades alfa4/alfa6 GABA-A.

AIM2 WP2.1: Registros patch-clamp de corrientes sinápticas GABA-A espontáneas y evocadas de interneuronas y células piramidales y su modulación por las mismas herramientas farmacológicas que en el Objetivo 1, WP2.2: Registros patch-clamp de sinápticas glutamatérgicas espontáneas y evocadas corrientes de interneuronas y células piramidales y su modulación por los moduladores alostéricos positivos y negativos de GABA.

AIM3 WP 3.1:Incremento de la liberación de GABA, mediante el registro de corrientes espontáneas en neuronas piramidales, modulando, mediante moduladores alostéricos, los receptores colinérgicos, dopaminérgicos y serotoninérgicos.

Metodologías y análisis estadísticos:

Durante el abordaje neuroquirúrgico, se usará 1 cm cúbico de tejido biopsico total para experimentos ex-vivo. Cortes transversales neocorticales o hipocampales (350 μm de espesor) se cortarán en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) a base de glicerol con un vibratomo (Leica VT 1000S ) inmediatamente después de la resección quirúrgica. Los cortes se colocarán en una cámara de incubación de cortes a temperatura ambiente con ACSF oxigenado y se transferirán a una cámara de registro dentro de 1-24 h después de la preparación del corte. Los registros de patch-clamp de células enteras se realizarán en células piramidales o interneuronas a 22-25 °C.

Tanto las corrientes postsinápticas espontáneas o en miniatura excitatorias como inhibidoras se registrarán utilizando un amplificador Multiclamp 700B (Axon Instruments, Foster City, CA, EE. UU.), potencial de retención de -70 mV, en presencia de TTX, 1 microM, CNQX, 20 microM y ( AP5, 40 microM para bloquear las corrientes de sodio, los receptores AMPA, kainato y NMDA respectivamente o en presencia de bicuculina (20 microM) y CGP55845 (50 nM) para bloquear los receptores GABA -A y -B cuando sea necesario. Las pipetas de parche se llenarán con la solución intracelular que contiene: KCl 140 mM, HEPES 10 mM, EGTA 0,5 mM y Mg-ATP 2 mM (pH 7,35, con KOH). Las resistencias de entrada y en serie se monitorearán durante los experimentos cada cinco minutos, y los cambios de >10 % excluyeron a la celda de un análisis posterior. El agonista o antagonista del receptor GABA-A se administrará a las células mediante perfusión en la solución del baño durante 10 minutos.

Químicos y Soluciones. ACSF tendrá la siguiente composición: NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 10 mM, piruvato de sodio 0,1 mM (pH 7,35). La solución ACSF a base de glicerol contendrá glicerol 250 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2,4 mM, MgCl2 1,2 mM, NaH2PO4 1,2 mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 11 mM y piruvato de sodio 0,1 mM (pH 7,35).

Análisis de datos y estadísticas. El análisis de los parámetros electrofisiológicos se realizará con el software Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, EE. UU.) mediante el uso de un algoritmo de detección basado en una plantilla deslizante. Para caracterizar las corrientes se utilizará: i) el tiempo de subida (estimado como el tiempo necesario para un aumento del 10-90% de la respuesta de corriente pico); ii) el tiempo de caída (como el tiempo necesario para una disminución del 90-10% de la corriente máxima); iii) la carga media de un solo evento sináptico, Q (medida como la integral de tiempo de las corrientes); vi) amplitud y v) frecuencia de eventos sinápticos. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron con la prueba ANOVA de una vía (prueba de normalidad de Shapiro-Wilk; prueba de igual varianza) y todas las comparaciones múltiples por pares con el método de Holm-Sidak. El poder de todas las pruebas realizadas fue > 0,8 (alfa=0,05). P<0,05 se tomó como significativo. En caso de fracaso de la prueba de normalidad o prueba de igual varianza, se utilizó ANOVA de rangos de una vía de Kruskal-Wallis, con el método de Dunn para comparaciones por pares.

Para calcular el número de participantes (n pacientes=n de células) utilizamos "El método iterativo de Camussi et al., 1995". siguiendo la relación donde n es el número de neuronas humanas: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, donde sigma debe ser sustituido por una estimación de la varianza muestral (s^2), alpha=0.05, z*alpha=-2, y D es la diferencia entre tratamientos. Con esta consideración, serán necesarios 12 pacientes por cada WPI descrito anteriormente. En total 60 pacientes participarán en el estudio en 5 años.

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