Funktionaalinen tutkimus inhiboivasta neurotransmissiosta ihmisen epilepsiaaivoissa.

Hankkeella on kolme tavoitetta:

1. Spesifisen agonistin, muskimolin, aiheuttamien makroskooppisten GABA-A-välitteisten virtojen karakterisointi selektiivisten negatiivisten ja positiivisten allosteeristen modulaattoreiden läsnä ollessa alayksikön koostumuksen tunnistamiseksi.
2. Hippokampuksen ja aivokuoren pyramidaalisista neuroneista tallennettujen synaptisten GABA-A-välitteisten virtojen toiminnallinen karakterisointi käyttämällä farmakologisia työkaluja.
3. Tavoitteista 1) ja 2) hankitun tiedon jälkeen epileptisen kudoksen estoäänen nousun edistäminen, GABA:n vapautumisen tehostaminen interneuroneista pääsoluihin stimuloimalla muita aivoissa olevia välittäjäainejärjestelmiä: kolinerginen järjestelmä, serotonerginen järjestelmä, ja dopaminerginen järjestelmä.

Kokeellinen suunnittelu:

AIM1 WP1.1: Patch-clamp-tallenteet kokosoluista GABA-A-välitteisistä virroista muskimolin aiheuttamista pyramidaalisista ja interneuroneista, jotka perfusoivat viipaleita positiivisilla allosteerisilla modulaattoreilla, kuten diatsepaami tai nitratsepaami, jotka ovat selektiivisiä apha1/alpha2-alayksiköille. sisältävät reseptoreja tai fenobarbitaalia, jotka ovat selektiivisiä alfa4/alfa6-alayksiköille GABA-A:ta sisältäville reseptoreille.

WP 1.2: Patch-clamp-tallenteet kokosolujen GABA-A-välitteisistä virroista muskimolin aiheuttamista pyramidaalisista ja interneuroneista, jotka perfusoivat viipaleita negatiivisilla allosteerisilla modulaattoreilla, kuten BetaCCT, joka on selektiivinen apha1/alpha2-alayksiköille GABA-A5 sisältäville reseptoreille tai L65-reseptoreille ,708 ja furosemidi, jotka ovat selektiivisiä alfa4/alfa6-alayksiköitä GABA-A sisältäville reseptoreille.

AIM2 WP2.1: Patch-clamp-tallenteet spontaaneista ja herätetyistä GABA-A-synaptisista virroista interneuroneista ja pyramidisoluista ja niiden modulaatio samoilla farmakologisilla työkaluilla kuin Tavoite 1, WP2.2: Patch-clamp-tallenteet spontaaneista ja herätetyistä synaptisista glutamatergiikkavirroista virrat interneuroneista ja pyramidisoluista ja niiden modulaatio GABA-positiivisilla ja negatiivisilla allosteerisilla modulaattoreilla.

AIM3 WP 3.1: GABA:n vapautumisen lisääminen tallentamalla spontaaneja virtoja pyramidaalisissa hermosoluissa, moduloimalla allosteeristen modulaattoreiden avulla kolinergisiä, dopaminergisiä ja serotonergisiä reseptoreita.

Metodologiat ja tilastolliset analyysit:

Neurokirurgisen lähestymistavan aikana 1 kuutiosenttimetriä koko biopsiakudosta käytetään ex vivo -kokeissa. Transversaaliset neokortikaali- tai hippokampuksen viipaleet (paksuus 350 μm) leikataan glyserolipohjaiseen keinotekoiseen aivo-selkäydinnesteeseen (ACSF) vibratomilla (Leica VT 1000S 1000S) ) välittömästi leikkauksen jälkeen. Viipaleet asetetaan viipaleiden inkubointikammioon huoneenlämpötilaan hapetetun ACSF:n kanssa ja siirretään tallennuskammioon 1–24 tunnin kuluessa viipaleen valmistamisesta. Kokosoluiset patch-clamp -tallenteet tehdään pyramidisoluille tai interneuroneille 22-25 °C:ssa.

Sekä kiihottavat että estävät spontaanit tai miniatyyri postsynaptiset virrat tallennetaan käyttämällä Multiclamp 700B -vahvistinta (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), -70 mV:n pitopotentiaalia, kun läsnä on TTX, 1 mikroM, CNQX, 20 mikroM ja ( AP5, 40 mikroM natriumvirtojen, AMPA-, kainaatti- ja NMDA-reseptorien salpaamiseen tai bikukuliinin (20 mikroM) ja CGP55845:n (50 nM) läsnä ollessa estämään GABA-A- ja -B-reseptorit tarvittaessa. Patch-pipetit täytetään solunsisäisellä liuoksella, joka sisältää: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA ja 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, KOH:lla). Tulo- ja sarjaresistanssia seurataan kokeiden aikana viiden minuutin välein, ja >10 % muutokset sulkivat solun pois jatkoanalyysistä. GABA-A-reseptorin agonisti tai antagonisti annetaan soluille perfuusiolla kylpyliuoksessa 10 minuutin ajan.

Kemikaalit ja ratkaisut. ACSF:llä on seuraava koostumus: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2P04, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHC03, 10 mM glukoosi, 0,1 mM Na-pyruvaatti (pH 7,35). Glyserolipohjainen ACSF-liuos sisältää 250 mM glyserolia, 2,5 mM KCl:a, 2,4 mM CaCl2:a, 1,2 mM MgCl2:a, 1,2 mM NaH2PO4:a, 26 mM NaHC03:a, 11 mM glukoosia ja 0,1 mM Na-7 pyruvaattia (5,3 mM Na-7pH).

Tietojen analysointi ja tilastot. Elektrofysiologisten parametrien analyysi suoritetaan Clampfit 10 -ohjelmistolla (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) käyttämällä liukuvaan mallipohjaan perustuvaa tunnistusalgoritmia. Virtojen karakterisoimiseen käytetään: i) nousuaikaa (arvioitu aikana, joka tarvitaan 10-90 %:n kasvuun huippuvirran vasteesta); ii) vaimennusaika (aikana, joka tarvitaan huippuvirran 90-10 %:n laskuun); iii) yksittäisen synaptisen tapahtuman keskimääräinen varaus, Q (mitattu virtojen aikaintegraalina); vi) synaptisten tapahtumien amplitudi ja v) taajuus. Tilastolliset vertailut ryhmien välillä tehtiin One Way ANOVA -testillä (Shapiro-Wilk-normaalisuustesti; tasavarianssitesti) ja kaikki pareittain tehdyt moninkertaiset vertailut Holm-Sidak-menetelmällä. Kaikkien suoritettujen testien teho oli > 0,8 (alfa=0,05). P < 0,05 pidettiin merkitsevänä. Normaliteettitestin tai tasavarianssitestin epäonnistuessa käytettiin Kruskal-Wallis One Way ANOVAa riveissä, Dunnin menetelmällä parivertailuihin.

Osallistujien lukumäärän laskemiseen (n potilasta = n solua) käytämme "The iterative method of Camussi et al., 1995." seuraamalla suhdetta, jossa n on ihmisen hermosolujen lukumäärä: n>2sigma^2 (z* alfa/D)^2, jossa sigma on korvattava arviolla otantavarianssista (s^2), alfa=0,05, z*alfa=-2, ja D on hoitojen välinen ero. Tämän huomioon ottaen kutakin aiemmin kuvattua WPI:tä kohden tarvitaan 12 potilasta. Viiden vuoden aikana tutkimukseen osallistuu yhteensä 60 potilasta.

.