Funktionelle Untersuchung der inhibitorischen Neurotransmission im menschlichen epileptischen Gehirn.

Das Projekt verfolgt 3 Ziele:

1. Charakterisierung makroskopischer GABA-A-vermittelter Ströme, die durch den spezifischen Agonisten Muscimol in Anwesenheit selektiver negativer und positiver allosterischer Modulatoren hervorgerufen werden, um die Zusammensetzung der Untereinheit zu identifizieren.
2. Funktionelle Charakterisierung von synaptischen GABA-A-vermittelten Strömen, die von Hippocampus- und kortikalen Pyramidenneuronen aufgezeichnet wurden, unter Verwendung pharmakologischer Werkzeuge.
3. Nach der erworbenen Kenntnis der Ziele 1) und 2), Förderung der Erhöhung des Hemmtonus in epileptischem Gewebe, Steigerung der GABA-Freisetzung aus Interneuronen auf Hauptzellen, durch Stimulierung anderer im Gehirn vorhandener Neurotransmittersysteme: cholinerges System, serotonerges System, und dopaminerges System.

Experimentelles Design:

AIM1 WP1.1: Patch-Clamp-Aufnahmen von Ganzzell-GABA-A-vermittelten Strömen von Pyramiden- und Interneuronen, die durch Muscimol hervorgerufen werden, wobei die Scheiben mit positiven allosterischen Modulatoren wie Diazepam oder Nitrazepam perfundiert werden, die selektiv für die apha1/alpha2-Untereinheiten GABA-A sind enthaltende Rezeptoren oder Phenobarbital, das für alpha4/alpha6-Untereinheiten GABA-A-enthaltende Rezeptoren selektiv ist.

AP 1.2: Patch-Clamp-Aufnahmen von Ganzzell-GABA-A-vermittelten Strömen von Pyramiden- und Interneuronen, hervorgerufen durch Muscimol, Perfundieren der Schnitte mit negativen allosterischen Modulatoren wie BetaCCT, das selektiv für apha1/alpha2-Untereinheiten ist, die GABA-A-Rezeptoren enthalten, oder L655 ,708 und Furosemid, die für alpha4/alpha6-Untereinheiten GABA-A enthaltende Rezeptoren selektiv sind.

AIM2 WP2.1: Patch-Clamp-Aufnahmen von spontanen und evozierten GABA-A-Synapsenströmen von Interneuronen und Pyramidenzellen und ihre Modulation durch die gleichen pharmakologischen Werkzeuge wie in Ziel 1, WP2.2: Patch-Clamp-Aufnahmen von spontanen und evozierten glutamatergen Synapsen Ströme von Interneuronen und Pyramidenzellen und ihre Modulation durch die positiven und negativen allosterischen GABA-Modulatoren.

AIM3 AP 3.1: Erhöhung der GABA-Freisetzung durch Aufzeichnung spontaner Ströme in Pyramidenneuronen, Modulation mittels allosterischer Modulatoren der cholinergen, dopaminergen und serotonergen Rezeptoren.

Methoden und statistische Analysen:

Während des neurochirurgischen Ansatzes wird 1 Kubikzentimeter des gesamten Biopsiegewebes für Ex-vivo-Experimente verwendet. Transversale neokortikale oder hippocampale Schnitte (350 μm Dicke) werden mit einem Vibratom (Leica VT 1000S ) unmittelbar nach chirurgischer Resektion. Die Scheiben werden bei Raumtemperatur mit sauerstoffangereichertem ACSF in eine Scheibeninkubationskammer gelegt und innerhalb von 1-24 h nach der Scheibenpräparation in eine Aufzeichnungskammer überführt. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen werden an Pyramidenzellen oder Interneuronen bei 22-25°C durchgeführt.

Sowohl erregende als auch hemmende spontane oder miniaturisierte postsynaptische Ströme werden unter Verwendung eines Multiclamp 700B-Verstärkers (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), -70 mV Haltepotential, in Gegenwart von TTX, 1 Mikrometer, CNQX, 20 Mikrometer und ( AP5, 40 microM zur Blockierung von Natriumströmen, AMPA-, Kainat- bzw. NMDA-Rezeptoren oder in Gegenwart von Bicucullin (20 microM) und CGP55845 (50 nM) zur Blockierung von GABA-A- und -B-Rezeptoren, falls erforderlich. Patch-Pipetten werden mit der intrazellulären Lösung gefüllt, die Folgendes enthält: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA und 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, mit KOH). Eingangs- und Reihenwiderstände werden während der Experimente alle fünf Minuten überwacht, und Änderungen von >10 % schlossen die Zelle von der weiteren Analyse aus. GABA-A-Rezeptor-Agonist oder -Antagonist wird den Zellen durch Perfusion in der Badlösung für 10 Minuten verabreicht.

Chemikalien und Lösungen. ACSF hat die folgende Zusammensetzung: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM Glucose, 0,1 mM Na-Pyruvat (pH 7,35). Glycerol-basierte ACSF-Lösung enthält 250 mM Glycerol, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM Glucose und 0,1 mM Na-Pyruvat (pH 7,35).

Datenanalyse und Statistik. Die Analyse der elektrophysiologischen Parameter wird mit der Software Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) unter Verwendung eines Detektionsalgorithmus basierend auf einer Gleitschablone durchgeführt. Um die Ströme zu charakterisieren, werden verwendet: i) die Anstiegszeit (geschätzt als die Zeit, die für eine 10–90%ige Erhöhung der Spitzenstromantwort benötigt wird); ii) die Abklingzeit (als die Zeit, die für eine 90–10%ige Abnahme des Spitzenstroms benötigt wird); iii) die mittlere Ladung eines einzelnen synaptischen Ereignisses Q (gemessen als Zeitintegral der Ströme); vi) Amplitude und v) Frequenz synaptischer Ereignisse. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit dem Einweg-ANOVA-Test (Shapiro-Wilk-Normalitätstest; gleicher Varianztest) und alle paarweisen Mehrfachvergleiche mit der Holm-Sidak-Methode durchgeführt. Die Power aller durchgeführten Tests war > 0,8 (alpha=0,05). P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Im Fall des Nichtbestehens des Normalitätstests oder des Tests auf gleiche Varianz wurde eine Kruskal-Wallis-Einweg-ANOVA auf Rängen mit Dunns Methode für paarweise Vergleiche verwendet.

Zur Berechnung der Teilnehmerzahl (n Patienten = n Zellen) verwenden wir „The iterative method of Camussi et al., 1995“. nach der Beziehung, wobei n die Anzahl menschlicher Neuronen ist: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, wobei sigma durch eine Schätzung der Stichprobenvarianz (s^2) ersetzt werden muss, alpha=0,05, z*alpha=-2 und D ist die Differenz zwischen den Behandlungen. Bei dieser Überlegung sind 12 Patienten für jeden zuvor beschriebenen WPI erforderlich. Insgesamt werden 60 Patienten in 5 Jahren an der Studie teilnehmen.

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