인간 간질 뇌에서 억제성 신경전달의 기능적 연구.

이 프로젝트는 3가지 목표를 제시합니다.

1. 서브유닛 구성을 식별하기 위한 선택적 음성 및 양성 알로스테릭 조절자의 존재 하에 특정 작용제인 muscimol에 의해 유발되는 거시적 GABA-A 매개 전류의 특성화.
2. 약리학적 도구를 사용하여 해마 및 피질 피라미드 뉴런에서 기록된 시냅스 GABA-A 매개 전류의 기능적 특성화.
3. 목표 1)과 2)에 대한 지식을 습득한 후 뇌에 존재하는 다른 신경 전달 물질 시스템(콜린성 시스템, 세로토닌성 시스템, 및 도파민 시스템.

실험적 설계:

AIM1 WP1.1: apha1/alpha2 서브유닛 GABA-A에 대해 선택적인 diazepam 또는 nitrazepam과 같은 양성 알로스테릭 조절제로 슬라이스를 관류하는 muscimol에 의해 유발된 피라미드 및 개재뉴런에서 전체 세포 GABA-A 매개 전류의 패치 클램프 기록 수용체 또는 알파4/알파6 소단위 GABA-A 함유 수용체에 대해 선택적인 페노바르비탈을 포함합니다.

WP 1.2: 수용체 또는 L655를 포함하는 apha1/alpha2 서브유닛 GABA-A에 대해 선택적인 BetaCCT와 같은 음성 알로스테릭 변조기로 슬라이스를 관류하는 muscimol에 의해 유발된 피라미드형 및 중간뉴런으로부터의 전체 세포 GABA-A 매개 전류의 패치 클램프 기록 ,708 및 알파4/알파6 서브유닛 GABA-A 함유 수용체에 대해 선택적인 푸로세마이드.

AIM2 WP2.1: 목표 1, WP2.2: 자발적 및 유발 글루탐산 시냅스의 패치 클램프 기록과 동일한 약리학적 도구에 의한 인터뉴런 및 피라미드 세포의 자발적 및 유발 GABA-A 시냅스 전류의 패치 클램프 기록 및 이들의 변조 인터뉴런 및 피라미드 세포로부터의 전류 및 GABA 양성 및 음성 알로스테릭 조절자에 의한 이들의 조절.

AIM3 WP 3.1: 알로스테릭 조절제를 통해 콜린성, 도파민성 및 세로토닌성 수용체를 조절하는 피라미드 뉴런의 자발 전류를 기록하여 GABA 방출의 증가.

방법론 및 통계 분석:

신경외과적 접근법 동안 전체 생체 조직의 1 입방 cm가 생체 외 실험에 사용됩니다. 횡단 신피질 또는 해마 절편(두께 350μm)은 vibratome(Leica VT 1000S)을 사용하여 글리세롤 기반 인공 뇌척수액(ACSF)에서 절단됩니다. ) 수술적 절제 직후. 슬라이스는 ACSF 산소가 함유된 실온에서 슬라이스 인큐베이션 챔버에 배치되고 슬라이스 준비 후 1-24시간 이내에 기록 챔버로 전송됩니다. 전체 세포 패치 클램프 기록은 22-25°C에서 피라미드형 세포 또는 중간 뉴런에서 수행됩니다.

TTX, 1 microM, CNQX, 20microM 및 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Axon Instruments), -70 mV 유지 전위에서 흥분성 및 억제성 자발적 또는 소형 포스트 시냅스 전류 모두 Multiclamp 700B 증폭기(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)를 사용하여 기록됩니다. AP5, 40microM은 각각 나트륨 전류, AMPA, kainate 및 NMDA 수용체를 차단하거나 bicuculline(20 microM) 및 CGP55845(50nM)가 있는 경우 GABA -A 및 -B 수용체를 차단합니다. 패치 피펫은 140mM KCl, 10mM HEPES, 0.5mM EGTA 및 2mM Mg-ATP(pH 7.35, KOH 포함)를 포함하는 세포내 용액으로 채워집니다. 입력 및 직렬 저항은 실험 중에 5분마다 모니터링되며 >10% 변화는 추가 분석에서 셀을 제외했습니다. GABA-A 수용체 작용제 또는 길항제는 욕 용액에서 10분 동안 관류에 의해 세포에 투여될 것이다.

화학 물질 및 솔루션. ACSF는 125mM NaCl, 2.5mM KCl, 2mM CaCl2, 1.25mM NaH2PO4, 1mM MgCl2, 26mM NaHCO3, 10mM 포도당, 0.1mM Na-피루베이트(pH 7.35)의 구성을 갖습니다. 글리세롤 기반 ACSF 용액은 250mM 글리세롤, 2.5mM KCl, 2.4mM CaCl2, 1.2mM MgCl2, 1.2mM NaH2PO4, 26mM NaHCO3, 11mM 포도당 및 0.1mM Na-피루베이트(pH 7.35)를 포함합니다.

데이터 분석 및 통계. 전기생리학적 파라미터의 분석은 슬라이딩 템플릿 기반의 검출 알고리즘을 사용하여 Clampfit 10 소프트웨어(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)로 수행됩니다. 전류를 특성화하기 위해 i) 상승 시간(피크 전류 응답의 10-90% 증가에 필요한 시간으로 추정); ii) 소멸 시간(피크 전류의 90-10% 감소에 필요한 시간) iii) 단일 시냅스 이벤트의 평균 전하, Q(전류의 시간 적분으로 측정됨); vi) 진폭 및 v) 시냅스 이벤트의 빈도. 그룹 간의 통계적 비교는 One Way ANOVA 테스트(Shapiro-Wilk 정규성 테스트; 등분산 테스트) 및 Holm-Sidak 방법을 사용한 모든 쌍별 다중 비교로 이루어졌습니다. 수행된 모든 테스트의 검정력은 > 0.8(알파=0.05)이었습니다. P<0.05를 유의한 것으로 간주했습니다. 정규성 검정 또는 등분산 검정이 실패한 경우 순위에 대한 Kruskal-Wallis One Way ANOVA를 사용하고 쌍별 비교를 위한 Dunn의 방법을 사용했습니다.

참가자 수(n명의 환자 = n개의 세포)를 계산하기 위해 "The iterative method of Camussi et al., 1995"를 사용합니다. 여기서 n은 인간 뉴런의 수인 관계를 따릅니다: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, 여기서 sigma는 샘플링 분산의 추정치(s^2), alpha=0.05로 대체되어야 합니다. z*alpha=-2, D는 처리 간의 차이입니다. 이러한 고려를 통해 앞서 설명한 각 WPI에 대해 12명의 환자가 필요합니다. 총 60명의 환자가 5년 동안 연구에 참여할 예정입니다.

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