Estudo Funcional da Neurotransmissão Inibitória no Cérebro Epiléptico Humano.

O projeto apresenta 3 objetivos:

1. Caracterização de correntes mediadas por GABA-A macroscópicas evocadas pelo agonista específico, muscimol, na presença de moduladores alostéricos negativos e positivos seletivos para identificar a composição da subunidade.
2. Caracterização funcional de correntes sinápticas mediadas por GABA-A registradas de neurônios piramidais hipocampais e corticais usando ferramentas farmacológicas.
3. Após o conhecimento adquirido dos objetivos 1) e 2), promoção do aumento do tônus ​​inibitório no tecido epiléptico, potencializando a liberação de GABA dos interneurônios para as células principais, por estimulação de outros sistemas neurotransmissores presentes no cérebro: sistema colinérgico, sistema serotoninérgico, e sistema dopaminérgico.

Design experimental:

AIM1 WP1.1: Registros de patch-clamp de correntes mediadas por GABA-A de células inteiras de piramidais e interneurônios evocados por muscimol, perfundindo as fatias com moduladores alostéricos positivos, como diazepam ou nitrazepam, que são seletivos para as subunidades apha1/alpha2 GABA-A contendo receptores ou fenobarbital seletivo para subunidades alfa4/alfa6 GABA-A contendo receptores.

WP 1.2: Registros de patch-clamp de correntes mediadas por GABA-A de células inteiras de piramidais e interneurônios evocados por muscimol, perfundindo as fatias com moduladores alostéricos negativos, como BetaCCT, que é seletivo para subunidades apha1/alpha2 GABA-A contendo receptores ou L655 ,708 e Furosemida que são seletivos para subunidades alfa4/alfa6 GABA-A contendo receptores.

AIM2 WP2.1: Registros Patch-clamp de correntes sinápticas GABA-A espontâneas e evocadas de interneurônios e células piramidais e sua modulação pelas mesmas ferramentas farmacológicas do Objetivo 1, WP2.2: Registros Patch-clamp de sinápticas glutamatérgicas espontâneas e evocadas correntes de interneurônios e células piramidais e sua modulação pelos moduladores alostéricos positivos e negativos do GABA.

AIM3 WP 3.1:Aumento da liberação de GABA, registrando correntes espontâneas em neurônios piramidais, modulando, por meio de moduladores alostéricos, os receptores colinérgicos, dopaminérgicos e serotoninérgicos.

Metodologias e análises estatísticas:

Durante a abordagem neurocirúrgica, 1 cm cúbico de tecido biopsic total será usado para experimentos ex-vivo. Cortes transversais neocorticais ou hipocampais (espessura de 350 μm) serão cortados em líquido cefalorraquidiano artificial à base de glicerol (ACSF) com um vibratome (Leica VT 1000S ) imediatamente após a ressecção cirúrgica. As fatias serão colocadas em uma câmara de incubação de fatias à temperatura ambiente com ACSF oxigenado e transferidas para uma câmara de registro dentro de 1-24 h após a preparação da fatia. Gravações de patch-clamp de células inteiras serão realizadas em células piramidais ou interneurônios a 22-25°C.

Ambas as correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias espontâneas ou em miniatura serão registradas usando um amplificador Multiclamp 700B (Axon Instruments, Foster City, CA, EUA), potencial de manutenção de -70 mV, na presença de TTX, 1 microM, CNQX, 20microM e ( AP5, 40microM para bloquear as correntes de sódio, AMPA, cainato e receptores NMDA respectivamente ou na presença de bicuculina (20 microM) e CGP55845 (50nM) para bloquear os receptores GABA -A e -B quando necessário. As pipetas adesivas serão preenchidas com a solução intracelular contendo: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA e 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, com KOH). As resistências de entrada e série serão monitoradas durante os experimentos a cada cinco minutos, e mudanças >10% excluíram a célula de análise posterior. O agonista ou antagonista do receptor GABA-A será administrado às células por perfusão na solução de banho por 10 minutos.

Produtos Químicos e Soluções. O ACSF terá a seguinte composição: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glicose, 0,1 mM Na-piruvato (pH 7,35). A solução de ACSF à base de glicerol conterá 250 mM de glicerol, 2,5 mM de KCl, 2,4 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2, 1,2 mM de NaH2PO4, 26 mM de NaHCO3, 11 mM de glicose e 0,1 mM de Na-piruvato (pH 7,35).

Análise de dados e estatísticas. A análise dos parâmetros eletrofisiológicos será realizada com o software Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, EUA) usando um algoritmo de detecção baseado em um modelo deslizante. Para caracterizar as correntes será utilizado: i) o tempo de subida (estimado como o tempo necessário para um aumento de 10-90% da resposta da corrente de pico); ii) o tempo de decaimento (como o tempo necessário para diminuição de 90-10% da corrente de pico); iii) a carga média de um único evento sináptico, Q (medida como a integral temporal das correntes); vi) amplitude ev) frequência de eventos sinápticos. As comparações estatísticas entre os grupos foram feitas com o teste One Way ANOVA (teste de normalidade Shapiro-Wilk; teste de variância igual) e todas as comparações múltiplas pareadas com o método Holm-Sidak. O poder de todos os testes realizados foi > 0,8 (alfa=0,05). P<0,05 foi considerado significativo. Em caso de falha no teste de normalidade ou no teste de variância igual, utilizou-se o Kruskal-Wallis One Way ANOVA nas classificações, com o método de Dunn para comparações pareadas.

Para calcular o número de participantes (n pacientes=n de células) usamos "O método iterativo de Camussi et al., 1995." seguindo a relação em que n é o número de neurônios humanos: n>2sigma^2 (z* alfa/D)^2, onde sigma deve ser substituído por uma estimativa da variância de amostragem (s^2), alfa=0,05, z*alfa=-2, e D é a diferença entre os tratamentos. Com essa consideração, serão necessários 12 pacientes para cada WPI descrito anteriormente. No total, 60 pacientes estarão envolvidos no estudo em 5 anos.

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