Функциональное исследование тормозной нейротрансмиссии в эпилептическом мозге человека.

Проект представляет 3 цели:

1. Характеристика макроскопических токов, опосредованных ГАМК-А, вызванных специфическим агонистом, мусцимолом, в присутствии селективных отрицательных и положительных аллостерических модуляторов для определения субъединичного состава.
2. Функциональная характеристика синаптических токов, опосредованных ГАМК-А, зарегистрированных в пирамидных нейронах гиппокампа и коры головного мозга с использованием фармакологических инструментов.
3. После приобретения знаний о целях 1) и 2) стимулирование повышения тормозного тонуса в эпилептической ткани, усиление высвобождения ГАМК из интернейронов в основные клетки путем стимуляции других нейромедиаторных систем, присутствующих в головном мозге: холинергической системы, серотонинергической системы, и дофаминергической системы.

Экспериментальная дизайн:

AIM1 WP1.1: Пэтч-клэмп записи токов, опосредованных цельноклеточной ГАМК-А, от пирамидных и интернейронов, вызванных мусцимолом, перфузирующих срезы положительными аллостерическими модуляторами, такими как диазепам или нитразепам, которые селективны в отношении субъединиц альфа1/альфа2 ГАМК-А. содержащие рецепторы или фенобарбитал, селективный в отношении альфа4/альфа6 субъединиц ГАМК-А, содержащих рецепторы.

WP 1.2: Пэтч-клэмп записи опосредованных ГАМК-А целых клеток токов от пирамидных и интернейронов, вызванных мусцимолом, перфузирующих срезы негативными аллостерическими модуляторами, такими как BetaCCT, который является селективным в отношении субъединиц альфа1/альфа2, содержащих ГАМК-А рецепторы или L655. ,708 и фуросемид, которые являются селективными в отношении рецепторов, содержащих альфа4/альфа6 субъединицы ГАМК-А.

AIM2 WP2.1: Запись спонтанных и вызванных ГАМК-А синаптических токов от интернейронов и пирамидных клеток и их модуляция с помощью тех же фармакологических инструментов, что и в цели 1, WP2.2: Запись с защелкой спонтанных и вызванных глутаматергических синаптических токи интернейронов и пирамидных клеток и их модуляция ГАМК положительными и отрицательными аллостерическими модуляторами.

AIM3 WP 3.1: Увеличение высвобождения ГАМК путем регистрации спонтанных токов в пирамидных нейронах, модуляции с помощью аллостерических модуляторов холинергических, дофаминергических и серотонинергических рецепторов.

Методологии и статистический анализ:

Во время нейрохирургического подхода 1 куб см общей биопсийной ткани будет использоваться для экспериментов ex vivo. Поперечные срезы неокортекса или гиппокампа (толщиной 350 мкм) будут разрезаны в искусственной спинномозговой жидкости на основе глицерина (ACSF) с помощью вибратома (Leica VT 1000S). ) сразу после хирургической резекции. Срезы будут помещены в инкубационную камеру для срезов при комнатной температуре с оксигенированным ACSF и перенесены в регистрационную камеру в течение 1-24 ч после приготовления срезов. Записи пэтч-кламп цельных клеток будут выполняться на пирамидальных клетках или интернейронах при 22-25°C.

Как возбуждающие, так и тормозные спонтанные или миниатюрные постсинаптические токи будут регистрироваться с использованием усилителя Multiclamp 700B (Axon Instruments, Фостер-Сити, Калифорния, США), удерживающий потенциал -70 мВ, в присутствии ТТХ, 1 мкМ, CNQX, 20 мкМ и ( AP5, 40 мкМ для блокирования токов натрия, AMPA, каинатных и NMDA-рецепторов соответственно или в присутствии бикукуллина (20 мкМ) и CGP55845 (50 нМ) для блокирования рецепторов ГАМК-А и -В, когда это необходимо. Патч-пипетки будут заполнены внутриклеточным раствором, содержащим: 140 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 0,5 мМ EGTA и 2 мМ Mg-АТФ (pH 7,35, с KOH). Входное и последовательное сопротивления будут контролироваться во время экспериментов каждые пять минут, и >10% изменений исключают ячейку из дальнейшего анализа. Агонист или антагонист рецептора ГАМК-А вводят в клетки путем перфузии в ванне с раствором в течение 10 минут.

Химикаты и растворы. ACSF будет иметь следующий состав: 125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1,25 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgCl2, 26 мМ NaHCO3, 10 мМ глюкозы, 0,1 мМ Na-пируват (pH 7,35). Раствор ACSF на основе глицерина будет содержать 250 мМ глицерина, 2,5 мМ KCl, 2,4 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgCl2, 1,2 мМ NaH2PO4, 26 мМ NaHCO3, 11 мМ глюкозы и 0,1 мМ пирувата натрия (pH 7,35).

Анализ данных и статистика. Анализ электрофизиологических параметров будет выполняться с помощью программного обеспечения Clampfit 10 (Axon Instruments, Фостер-Сити, Калифорния, США) с использованием алгоритма обнаружения на основе скользящего шаблона. Для характеристики токов будут использоваться: i) время нарастания (оцениваемое как время, необходимое для увеличения пикового тока на 10–90 %); ii) время затухания (как время, необходимое для снижения пикового тока на 90-10%); iii) средний заряд одного синаптического события, Q (измеряемый как временной интеграл токов); vi) амплитуда и v) частота синаптических событий. Статистические сравнения между группами были сделаны с помощью теста One Way ANOVA (критерий нормальности Шапиро-Уилка; критерий равной дисперсии), а все парные множественные сравнения - с помощью метода Холма-Сидака. Мощность всех проведенных тестов была > 0,8 (альфа = 0,05). P<0,05 считали значимым. В случае неудачи теста нормальности или теста равной дисперсии использовался однофакторный дисперсионный анализ Крускала-Уоллиса по рангам с методом Данна для попарных сравнений.

Для подсчета количества участников (n пациентов = n клеток) мы используем «Итеративный метод Камюсси и др., 1995». следуя соотношению, где n — количество нейронов человека: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, где sigma следует заменить оценкой дисперсии выборки (s^2), alpha=0,05, z*alpha=-2, а D — разница между обработками. С учетом этого потребуется 12 пациентов для каждого ранее описанного ИЗВ. Всего через 5 лет в исследование будет вовлечено 60 пациентов.

.