Functionele studie van remmende neurotransmissie in de menselijke epileptische hersenen.

Het project presenteert 3 doelstellingen:

1. Karakterisering van macroscopische GABA-A-gemedieerde stromen opgewekt door de specifieke agonist, muscimol, in aanwezigheid van selectieve negatieve en positieve allosterische modulatoren om de samenstelling van de subeenheid te identificeren.
2. Functionele karakterisering van synaptische GABA-A-gemedieerde stromen geregistreerd van hippocampale en corticale piramidale neuronen met behulp van farmacologische hulpmiddelen.
3. Na de verworven kennis van doelen 1) en 2), bevordering van de toename van remmende tonus in epileptisch weefsel, verbetering van de GABA-afgifte van interneuronen op hoofdcellen, door stimulatie van andere neurotransmittersystemen die in de hersenen aanwezig zijn: cholinerge systeem, serotonerge systeem, en dopaminerge systeem.

Experimenteel ontwerp:

AIM1 WP1.1: Patch-clamp-opnamen van GABA-A-gemedieerde stromen van hele cellen van piramidale en interneuronen opgewekt door muscimol, waarbij de plakjes worden doorbloed met positieve allosterische modulatoren zoals diazepam of nitrazepam, die selectief zijn voor apha1/alpha2-subeenheden GABA-A met receptoren of fenobarbital selectief voor alfa4/alpha6-subeenheden GABA-A-bevattende receptoren.

WP 1.2: Patch-clamp-opnamen van GABA-A-gemedieerde stromen in hele cellen van piramidale en interneuronen opgewekt door muscimol, waarbij de plakjes worden geperfuseerd met negatieve allosterische modulatoren zoals BetaCCT, dat selectief is voor apha1/alpha2-subeenheden GABA-A-bevattende receptoren of L655 ,708 en furosemide die selectief zijn voor alfa4/alfa6-subeenheden GABA-A-bevattende receptoren.

AIM2 WP2.1: Patch-clamp opnames van spontane en opgewekte GABA-A synaptische stromen van interneuronen en piramidale cellen en hun modulatie door dezelfde farmacologische tools als in Aim 1, WP2.2: Patch-clamp opnames van spontane en opgewekte glutamaterge synaptische stromen van interneuronen en piramidale cellen en hun modulatie door de GABA positieve en negatieve allosterische modulatoren.

AIM3 WP 3.1: Verhoging van de GABA-afgifte, door spontane stromen in piramidale neuronen te registreren, door middel van allosterische modulatoren de cholinerge, dopaminerge en serotonerge receptoren te moduleren.

Methodologieën en statistische analyses:

Tijdens de neurochirurgische benadering zal 1 kubus cm van het totale biopsieweefsel worden gebruikt voor ex-vivo-experimenten. Transversale neocorticale of hippocampale plakjes (350 μm dikte) zullen in op glycerol gebaseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) worden gesneden met een vibratoom (Leica VT 1000S ) onmiddellijk na chirurgische resectie. Plakjes worden bij kamertemperatuur in een plakincubatiekamer geplaatst met geoxygeneerde ACSF en binnen 1-24 uur na plakvoorbereiding overgebracht naar een opnamekamer. Patch-clamp-opnamen van hele cellen worden uitgevoerd op piramidale cellen of interneuronen bij 22-25°C.

Zowel prikkelende als remmende spontane of miniatuur post-synaptische stromen zullen worden geregistreerd met behulp van een Multiclamp 700B-versterker (Axon Instruments, Foster City, CA, VS), -70 mV houdpotentieel, in aanwezigheid van TTX, 1 microM, CNQX, 20microM en ( AP5, 40 microM om respectievelijk natriumstromen, AMPA-, kaïnaat- en NMDA-receptoren te blokkeren of in aanwezigheid van bicuculline (20 microM) en CGP55845 (50 nM) om GABA -A- en -B-receptoren te blokkeren indien nodig. Patchpipetten worden gevuld met de intracellulaire oplossing die bevat: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA en 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, met KOH). Input- en serieweerstanden zullen tijdens de experimenten om de vijf minuten worden gecontroleerd, en> 10% veranderingen sloten de cel uit voor verdere analyse. GABA-A-receptoragonist of -antagonist wordt aan de cellen toegediend door perfusie in de badoplossing gedurende 10 minuten.

Chemicaliën en oplossingen. ACSF heeft de volgende samenstelling: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, 0,1 mM Na-pyruvaat (pH 7,35). Op glycerol gebaseerde ACSF-oplossing bevat 250 mM glycerol, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM glucose en 0,1 mM Na-pyruvaat (pH 7,35).

Gegevensanalyse en statistiek. De analyse van elektrofysiologische parameters zal worden uitgevoerd met Clampfit 10-software (Axon Instruments, Foster City, CA, VS) met behulp van een detectie-algoritme op basis van een glijdende sjabloon. Om de stromen te karakteriseren zal het worden gebruikt: i) de stijgtijd (geschat als de tijd die nodig is voor een toename van 10-90% van de piekstroomrespons); ii) de vervaltijd (als de tijd die nodig is voor 90-10% afname van piekstroom); iii) de gemiddelde lading van een enkele synaptische gebeurtenis, Q (gemeten als de tijdsintegraal van de stromen); vi) amplitude en v) frequentie van synaptische gebeurtenissen. Statistische vergelijkingen tussen groepen werden gemaakt met de One Way ANOVA-test (Shapiro-Wilk normaliteitstest; gelijke variantietest) en alle paarsgewijze meervoudige vergelijkingen met de Holm-Sidak-methode. De power van alle uitgevoerde testen was > 0.8 (alfa=0.05). P<0,05 werd als significant beschouwd. In het geval dat de normaliteitstest of gelijke variantietest faalde, werd Kruskal-Wallis One Way ANOVA op rangen gebruikt, met Dunn's methode voor paarsgewijze vergelijkingen.

Om het aantal deelnemers (n patiënten = n cellen) te berekenen, gebruiken we "The iterative method of Camussi et al., 1995." volgens de relatie waarbij n het aantal menselijke neuronen is: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, waarbij sigma moet worden vervangen door een schatting van de steekproefvariantie (s^2), alpha=0,05, z*alpha=-2, en D is het verschil tussen behandelingen. Met deze overweging zijn er voor elke eerder beschreven WPI 12 patiënten nodig. In totaal zullen in 5 jaar tijd 60 patiënten bij de studie betrokken zijn.

.