Studio funzionale della neurotrasmissione inibitoria nel cervello epilettico umano.

Il progetto presenta 3 obiettivi:

1. Caratterizzazione delle correnti macroscopiche mediate da GABA-A evocate dall'agonista specifico muscimolo, in presenza di modulatori allosterici selettivi negativi e positivi per identificare la composizione delle subunità.
2. Caratterizzazione funzionale delle correnti sinaptiche mediate da GABA-A registrate dai neuroni ippocampali e piramidali corticali utilizzando strumenti farmacologici.
3. Dopo aver acquisito la conoscenza degli obiettivi 1) e 2), promozione dell'aumento del tono inibitorio nel tessuto epilettico, potenziando il rilascio di GABA dagli interneuroni sulle cellule principali, mediante stimolazione di altri sistemi di neurotrasmettitori presenti nel cervello: sistema colinergico, sistema serotoninergico, e sistema dopaminergico.

Design sperimentale:

AIM1 WP1.1: Registrazioni patch-clamp di correnti GABA-A mediate a cellule intere da piramidali e interneuroni evocati dal muscimolo, perfondendo le fette con modulatori allosterici positivi come diazepam o nitrazepam, che sono selettivi per le subunità afa1/alfa2 GABA-A contenenti recettori o fenobarbital selettivo per le subunità alfa4/alfa6 recettori contenenti GABA-A.

WP 1.2: Registrazioni patch-clamp di correnti mediate da GABA-A a cellula intera da piramidali e interneuroni evocati da muscimolo, perfondendo le fette con modulatori allosterici negativi come BetaCCT, che è selettivo per le subunità afa1/alfa2 contenenti recettori GABA-A o L655 ,708 e Furosemide che sono selettivi per le subunità alfa4/alfa6 contenenti recettori GABA-A.

AIM2 WP2.1: Registrazioni patch-clamp di correnti sinaptiche GABA-A spontanee ed evocate da interneuroni e cellule piramidali e loro modulazione mediante gli stessi strumenti farmacologici dell'obiettivo 1, WP2.2: Registrazioni patch-clamp di sinaptiche glutamatergiche spontanee ed evocate correnti da interneuroni e cellule piramidali e loro modulazione da parte dei modulatori allosterici positivi e negativi del GABA.

AIM3 WP 3.1: Aumento del rilascio di GABA, registrando le correnti spontanee nei neuroni piramidali, modulando, mediante modulatori allosterici, i recettori colinergici, dopaminergici e serotoninergici.

Metodologie e analisi statistiche:

Durante l'approccio neurochirurgico, 1 cm cubo di tessuto biopsico totale sarà utilizzato per esperimenti ex-vivo. Fettine trasversali neocorticali o ippocampali (spessore 350 μm) taglieranno nel liquido cerebrospinale artificiale a base di glicerolo (ACSF) con un vibratomo (Leica VT 1000S ) immediatamente dopo la resezione chirurgica. Le fettine saranno poste in una camera di incubazione delle fettine a temperatura ambiente con ACSF ossigenato e trasferite in una camera di registrazione entro 1-24 ore dalla preparazione delle fettine. Le registrazioni patch-clamp di cellule intere saranno eseguite su cellule piramidali o interneuroni a 22-25°C.

Le correnti post sinaptiche sia eccitatorie che inibitorie spontanee o in miniatura saranno registrate utilizzando un amplificatore Multiclamp 700B (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), potenziale di mantenimento di -70 mV, in presenza di TTX, 1 microM, CNQX, 20 microM e ( AP5, 40microM per bloccare le correnti di sodio, i recettori AMPA, kainato e NMDA rispettivamente o in presenza di bicucullina (20 microM) e CGP55845 (50nM) per bloccare i recettori GABA -A e -B quando necessario. Le patch pipette saranno riempite con la soluzione intracellulare contenente: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.5 mM EGTA e 2 mM Mg-ATP (pH 7.35, con KOH). Le resistenze in ingresso e in serie saranno monitorate durante gli esperimenti ogni cinque minuti e variazioni >10% escludono la cella da ulteriori analisi. L'agonista o l'antagonista del recettore GABA-A sarà somministrato alle cellule mediante perfusione nella soluzione del bagno per 10 minuti.

Prodotti chimici e soluzioni. ACSF avrà la seguente composizione: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucosio, 0,1 mM Na-piruvato (pH 7,35). La soluzione ACSF a base di glicerolo conterrà 250 mM di glicerolo, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM glucosio e 0,1 mM Na-piruvato (pH 7,35).

Analisi dei dati e statistiche. L'analisi dei parametri elettrofisiologici sarà eseguita con il software Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) utilizzando un algoritmo di rilevamento basato su un modello scorrevole. Per caratterizzare le correnti si utilizzerà: i) il tempo di salita (stimato come il tempo necessario per un aumento del 10-90% della risposta della corrente di picco); ii) il tempo di decadimento (come il tempo necessario per la diminuzione del 90-10% della corrente di picco); iii) la carica media di un singolo evento sinaptico, Q (misurata come integrale nel tempo delle correnti); vi) ampiezza e v) frequenza degli eventi sinaptici. I confronti statistici tra i gruppi sono stati effettuati con il test One Way ANOVA (test di normalità di Shapiro-Wilk; test di varianza uguale) e tutti i confronti multipli a coppie con il metodo Holm-Sidak. La potenza di tutti i test eseguiti era > 0,8 (alfa=0,05). P <0,05 è stato considerato significativo. In caso di fallimento del test di normalità o del test di varianza uguale, è stato utilizzato Kruskal-Wallis One Way ANOVA sui ranghi, con il metodo di Dunn per i confronti a coppie.

Per calcolare il numero di partecipanti (n pazienti=n di cellule) usiamo "Il metodo iterativo di Camussi et al., 1995". seguendo la relazione dove n è il numero di neuroni umani: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, dove sigma deve essere sostituito con una stima della varianza campionaria (s^2), alpha=0.05, z*alpha=-2, e D è la differenza tra i trattamenti. Con questa considerazione, saranno necessari 12 pazienti per ogni WPI precedentemente descritto. In totale 60 pazienti saranno coinvolti nello studio in 5 anni.

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