Funkční studie inhibiční neurotransmise v lidském epileptickém mozku.

Projekt má 3 cíle:

1. Charakterizace makroskopických proudů zprostředkovaných GABA-A vyvolaných specifickým agonistou, muscimolem, v přítomnosti selektivních negativních a pozitivních alosterických modulátorů k identifikaci složení podjednotky.
2. Funkční charakterizace synaptických proudů zprostředkovaných GABA-A zaznamenaných z hipokampálních a kortikálních pyramidálních neuronů pomocí farmakologických nástrojů.
3. Po nabytých znalostech cílů 1) a 2) podpora zvýšení inhibičního tonu v epileptické tkáni, zvýšení uvolňování GABA z interneuronů do hlavních buněk, stimulací dalších neurotransmiterových systémů přítomných v mozku: cholinergního systému, serotonergního systému, a dopaminergního systému.

Experimentální design:

AIM1 WP1.1: Patch-clamp záznamy celobuněčných proudů zprostředkovaných GABA-A z pyramidálních a interneuronů vyvolaných muscimolem, perfuze řezů pozitivními alosterickými modulátory, jako je diazepam nebo nitrazepam, které jsou selektivní pro podjednotky apha1/alpha2 GABA-A obsahující receptory nebo fenobarbital selektivní pro podjednotky alfa4/alpha6 GABA-A obsahující receptory.

WP 1.2: Patch-clamp záznamy celobuněčných GABA-A zprostředkovaných proudů z pyramidálních a interneuronů vyvolaných muscimolem, perfuze řezů negativními alosterickými modulátory, jako je BetaCCT, který je selektivní pro apha1/alpha2 podjednotky GABA-A obsahující receptory nebo L655 ,708 a Furosemid, které jsou selektivní pro podjednotky alfa4/alpha6 obsahující receptory GABA-A.

AIM2 WP2.1: Patch-clamp záznamy spontánních a evokovaných GABA-A synaptických proudů z interneuronů a pyramidálních buněk a jejich modulace stejnými farmakologickými nástroji jako v Cíli 1, WP2.2: Patch-clamp záznamy spontánních a evokovaných glutamátergních synaptických proudy z interneuronů a pyramidálních buněk a jejich modulace pozitivními a negativními alosterickými modulátory GABA.

AIM3 WP 3.1: Zvýšení uvolňování GABA záznamem spontánních proudů v pyramidálních neuronech, modulací pomocí alosterických modulátorů cholinergních, dopaminergních a serotonergních receptorů.

Metodiky a statistické analýzy:

Během neurochirurgického přístupu bude k ex-vivo experimentům použit 1 krychlový cm celkové bioptické tkáně. Transverzální neokortikální nebo hipokampální řezy (tloušťka 350 μm) budou řezány v umělém mozkomíšním moku na bázi glycerolu (ACSF) vibratomem (Leica VT 1000S ) bezprostředně po chirurgické resekci. Řezy budou umístěny do inkubační komory pro řezy při pokojové teplotě s okysličeným ACSF a přeneseny do záznamové komory během 1-24 hodin po přípravě řezů. Celobuněčné patch-clamp záznamy budou prováděny na pyramidových buňkách nebo interneuronech při 22-25°C.

Excitační i inhibiční spontánní nebo miniaturní post synaptické proudy budou zaznamenávány pomocí zesilovače Multiclamp 700B (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), udržovací potenciál -70 mV, v přítomnosti TTX, 1 mikroM, CNQX, 20 mikroM a ( AP5, 40 mikroM k blokování sodíkových proudů, AMPA, kainátových a NMDA receptorů nebo v přítomnosti bikukulinu (20 mikroM) a CGP55845 (50 nM) k blokování receptorů GABA -A a -B, je-li to nutné. Náplastové pipety se naplní intracelulárním roztokem obsahujícím: 140 mM KCI, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA a 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, s KOH). Vstupní a sériové odpory budou monitorovány během experimentů každých pět minut a >10% změny vyřadily článek z další analýzy. Agonista nebo antagonista receptoru GABA-A bude buňkám podáván perfuzí v roztoku lázně po dobu 10 minut.

Chemikálie a roztoky. ACSF bude mít následující složení: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2P04, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHC03, 10 mM glukóza, 0,1 mM Na-pyruvát 7,3 (pH). Roztok ACSF na bázi glycerolu bude obsahovat 250 mM glycerolu, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2P04, 26 mM NaHC03, 11 mM glukózy a 0,1 mM (5 mM Na-pyruvateH)

Analýza dat a statistika. Analýza elektrofyziologických parametrů bude provedena pomocí softwaru Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) s použitím detekčního algoritmu založeného na posuvné šabloně. Pro charakterizaci proudů bude použito: i) doba náběhu (odhadovaná jako doba potřebná pro 10-90% zvýšení odezvy špičkového proudu); ii) doba doznívání (jako doba potřebná pro 90-10% snížení špičkového proudu); iii) střední náboj jediné synaptické události, Q (měřený jako časový integrál proudů); vi) amplituda av) frekvence synaptických událostí. Statistická srovnání mezi skupinami byla provedena testem One Way ANOVA (Shapiro-Wilkův test normality; test stejné odchylky) a všechna párová vícenásobná srovnání s metodou Holm-Sidak. Síla všech provedených testů byla > 0,8 (alfa=0,05). P<0,05 bylo považováno za významné. V případě selhání testu normality nebo testu stejné odchylky byla použita Kruskal-Wallis One Way ANOVA na pořadí, s Dunnovou metodou pro párové srovnání.

Pro výpočet počtu účastníků (n pacientů = n buněk) používáme "Iterativní metodu Camussi et al., 1995." podle vztahu, kde n je počet lidských neuronů: n>2sigma^2 (z* alfa/D)^2, kde sigma musí být nahrazeno odhadem rozptylu vzorku (s^2), alfa=0,05, z*alfa=-2 a D je rozdíl mezi ošetřeními. S tímto uvážením bude zapotřebí 12 pacientů pro každý výše popsaný WPI. Během 5 let bude do studie zapojeno celkem 60 pacientů.

.