Funkcjonalne badanie neurotransmisji hamującej w ludzkim mózgu z padaczką.

Projekt przedstawia 3 cele:

1. Charakterystyka makroskopowych prądów, w których pośredniczy GABA-A, wywołanych przez specyficznego agonistę, muscymol, w obecności selektywnych negatywnych i dodatnich modulatorów allosterycznych w celu identyfikacji składu podjednostek.
2. Charakterystyka funkcjonalna prądów synaptycznych, w których pośredniczy GABA-A, zarejestrowanych z hipokampa i korowych neuronów piramidalnych za pomocą narzędzi farmakologicznych.
3. Po poznaniu celów 1) i 2) promowanie wzrostu napięcia hamującego w tkance padaczki, nasilenie uwalniania GABA z interneuronów do komórek głównych, poprzez stymulację innych układów neuroprzekaźnikowych obecnych w mózgu: układu cholinergicznego, układu serotonergicznego, i układ dopaminergiczny.

Projekt eksperymentalny:

AIM1 WP1.1: Nagrania patch-clamp prądów GABA-A, w których pośredniczy cała komórka, z neuronów piramidowych i interneuronów wywołanych przez muscimol, perfuzja skrawków dodatnimi modulatorami allosterycznymi, takimi jak diazepam lub nitrazepam, które są selektywne dla podjednostek apha1 / alfa2 GABA-A zawierające receptory lub fenobarbital selektywny dla podjednostek alfa4/alfa6 receptory zawierające GABA-A.

WP 1.2: Nagrania typu patch-clamp prądów GABA-A, w których pośredniczy cała komórka, z neuronów piramidowych i interneuronów wywołanych przez muscymol, perfuzja skrawków ujemnymi modulatorami allosterycznymi, takimi jak BetaCCT, który jest selektywny dla podjednostek apha1/alpha2 zawierających receptory GABA-A lub L655 ,708 i furosemid, które są selektywne dla receptorów zawierających podjednostki alfa4/alfa6 GABA-A.

AIM2 WP2.1: Zapisy patch-clamp spontanicznych i wywołanych prądów synaptycznych GABA-A z interneuronów i komórek piramidalnych oraz ich modulacja za pomocą tych samych narzędzi farmakologicznych, co w Aim 1, WP2.2: Zapisy patch-clamp spontanicznych i wywołanych synaptycznych glutaminergicznych prądy z interneuronów i komórek piramidalnych oraz ich modulacja przez dodatnie i ujemne modulatory allosteryczne GABA.

AIM3 WP 3.1: Zwiększenie uwalniania GABA, poprzez rejestrację spontanicznych prądów w neuronach piramidalnych, modulowanie za pomocą modulatorów allosterycznych receptorów cholinergicznych, dopaminergicznych i serotoninergicznych.

Metodyki i analizy statystyczne:

Podczas podejścia neurochirurgicznego do eksperymentów ex vivo zostanie wykorzystany 1 cm sześcienny całkowitej tkanki biopsyjnej. Poprzeczne skrawki kory nowej lub hipokampa (grubość 350 μm) zostaną pocięte w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym na bazie glicerolu (ACSF) za pomocą wibratomu (Leica VT 1000S) ) bezpośrednio po resekcji chirurgicznej. Skrawki zostaną umieszczone w komorze do inkubacji skrawków w temperaturze pokojowej z utlenionym ACSF i przeniesione do komory rejestrującej w ciągu 1-24 godzin po przygotowaniu skrawków. Zapisy metodą patch-clamp na całych komórkach będą wykonywane na komórkach piramidalnych lub interneuronach w temperaturze 22-25°C.

Zarówno pobudzające, jak i hamujące spontaniczne lub miniaturowe prądy postsynaptyczne będą rejestrowane przy użyciu wzmacniacza Multiclamp 700B (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), potencjał trzymania -70 mV, w obecności TTX, 1 mikroM, CNQX, 20 mikroM i ( AP5, 40 mikroM do blokowania prądów sodowych, receptorów odpowiednio AMPA, kainianowych i NMDA lub w obecności bikukuliny (20 mikroM) i CGP55845 (50 nM) do blokowania receptorów GABA -A i -B, gdy jest to konieczne. Pipety krosowe zostaną wypełnione roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA i 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, z KOH). Rezystancje wejściowe i szeregowe będą monitorowane podczas eksperymentów co pięć minut, a zmiany >10% wykluczają ogniwo z dalszej analizy. Agonista lub antagonista receptora GABA-A będzie podawany do komórek przez perfuzję w roztworze do kąpieli przez 10 minut.

Chemikalia i roztwory. ACSF będzie miał następujący skład: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukoza, 0,1 mM Na-pirogronian (pH 7,35). Roztwór ACSF na bazie glicerolu będzie zawierał 250 mM glicerolu, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM glukozy i 0,1 mM pirogronianu sodu (pH 7,35).

Analiza danych i statystyki. Analiza parametrów elektrofizjologicznych zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) z wykorzystaniem algorytmu detekcji opartego na przesuwanym szablonie. Do scharakteryzowania prądów zostaną wykorzystane: i) czas narastania (szacowany jako czas potrzebny do 10-90% wzrostu szczytowej odpowiedzi prądowej); ii) czas zaniku (jako czas potrzebny do spadku prądu szczytowego o 90-10%); iii) średni ładunek pojedynczego zdarzenia synaptycznego, Q (mierzony jako całka czasowa prądów); vi) amplituda i v) częstotliwość zdarzeń synaptycznych. Porównań statystycznych między grupami dokonano za pomocą testu One Way ANOVA (test normalności Shapiro-Wilka; test równej wariancji), a wszystkie wielokrotne porównania parami metodą Holma-Sidaka. Moc wszystkich przeprowadzonych testów wyniosła > 0,8 (alfa=0,05). P<0,05 przyjęto jako istotne. W przypadku niepowodzenia testu normalności lub testu równej wariancji zastosowano jednokierunkową ANOVA Kruskala-Wallisa na rangach z metodą Dunna do porównań parami.

Aby obliczyć liczbę uczestników (n pacjentów = n komórek) stosujemy „The iterative method of Camussi i in., 1995”. zgodnie z zależnością, gdzie n jest liczbą ludzkich neuronów: n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, gdzie sigma należy zastąpić estymatą wariancji próbkowania (s^2), alfa=0,05, z*alpha=-2, a D to różnica między zabiegami. Biorąc to pod uwagę, konieczne będzie 12 pacjentów dla każdego opisanego wcześniej WPI. Łącznie w ciągu 5 lat badaniem zostanie objętych 60 pacjentów.

.