Funksjonell studie av hemmende nevrotransmisjon i den humane epileptiske hjernen.

Prosjektet presenterer 3 mål:

1. Karakterisering av makroskopiske GABA-A-medierte strømmer fremkalt av den spesifikke agonisten, muscimol, i nærvær av selektive negative og positive allosteriske modulatorer for å identifisere underenhetssammensetningen.
2. Funksjonell karakterisering av synaptiske GABA-A-medierte strømmer registrert fra hippocampus og kortikale pyramidale nevroner ved bruk av farmakologiske verktøy.
3. Etter ervervet kunnskap om mål 1) og 2), fremme økningen av hemmende tonus i epileptisk vev, øke GABA-frigjøringen fra interneuroner til hovedceller, ved stimulering av andre nevrotransmittersystemer som er tilstede i hjernen: kolinergt system, serotonergt system, og dopaminerge system.

Eksperimentelt design:

AIM1 WP1.1: Patch-clamp-opptak av helcelle-GABA-A-medierte strømmer fra pyramidale og interneuroner fremkalt av muscimol, og perfuserer skivene med positive allosteriske modulatorer som diazepam eller nitrazepam, som er selektive for apha1/alpha2-underenheter GABA-A som inneholder reseptorer eller fenobarbital selektiv for alfa4/alfa6-underenheter GABA-A-holdige reseptorer.

WP 1.2: Patch-clamp-opptak av helcelle-GABA-A-medierte strømmer fra pyramidale og interneuroner fremkalt av muscimol, og perfuserer skivene med negative allosteriske modulatorer som BetaCCT, som er selektiv for apha1/alpha2-underenheter GABA-A-inneholdende reseptorer eller L655 ,708 og Furosemid som er selektive for alfa4/alfa6-underenheter GABA-A-holdige reseptorer.

AIM2 WP2.1: Patch-clamp-opptak av spontane og fremkalte GABA-A-synaptiske strømmer fra interneuroner og pyramideceller og deres modulering med de samme farmakologiske verktøyene som i Mål 1, WP2.2: Patch-clamp-opptak av spontane og fremkalte glutamatergiske synaptiske midler strømmer fra interneuroner og pyramidale celler og deres modulering av GABA positive og negative allosteriske modulatorer.

AIM3 WP 3.1: Økning av GABA-frigjøring, ved å registrere spontane strømmer i pyramidale nevroner, modulere, ved hjelp av allosteriske modulatorer, de kolinerge, dopaminerge og serotonerge reseptorene.

Metoder og statistiske analyser:

Under den nevrokirurgiske tilnærmingen vil 1 kube cm av totalt biopsivev bli brukt til ex-vivo eksperimenter. Transversale neokortikale eller hippocampale skiver (350 μm tykkelse) vil kutte i glyserolbasert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med et vibratom (Leica VT 1000S) ) umiddelbart etter kirurgisk reseksjon. Skiver vil bli plassert i et skiveinkubasjonskammer ved romtemperatur med oksygenert ACSF og overført til et opptakskammer innen 1-24 timer etter skiveforberedelse. Helcelle patch-clamp-opptak vil bli utført på pyramidale celler eller interneuroner ved 22-25°C.

Både eksitatoriske og hemmende spontane eller miniatyr postsynaptiske strømmer vil bli registrert ved bruk av en Multiclamp 700B forsterker (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), -70 mV holdepotensial, i nærvær av TTX, 1 mikroM, CNQX, 20 mikroM og ( AP5, 40 mikroM for å blokkere natriumstrømmer, henholdsvis AMPA-, kainat- og NMDA-reseptorer eller i nærvær av bicucullin (20 mikroM) og CGP55845 (50 nM) for å blokkere GABA-A- og -B-reseptorer når det er nødvendig. Patch-pipetter vil bli fylt med den intracellulære løsningen som inneholder: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA og 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, med KOH). Inngangs- og seriemotstander vil bli overvåket under eksperimentene hvert femte minutt, og >10 % endringer ekskluderte cellen fra videre analyse. GABA-A-reseptoragonist eller -antagonist vil bli administrert til cellene ved perfusjon i badeløsningen i 10 minutter.

Kjemikalier og løsninger. ACSF vil ha følgende sammensetning: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukose, 0,1 mM Na-pyruvat (pH 7,35). Glyserolbasert ACSF-løsning vil inneholde 250 mM glyserol, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM glukose og 0,1 mM Na-pyruvat (73).

Dataanalyse og statistikk. Analysen av elektrofysiologiske parametere vil bli utført med Clampfit 10-programvare (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) ved å bruke en deteksjonsalgoritme basert på en glidende mal. For å karakterisere strømmene vil den bli brukt: i) stigetiden (estimert som tiden nødvendig for 10-90 % økning av toppstrømresponsen); ii) forfallstiden (som tiden som trengs for 90-10 % reduksjon av toppstrøm); iii) gjennomsnittlig ladning av en enkelt synaptisk hendelse, Q (målt som tidsintegralet av strømmene); vi) amplitude og v) hyppighet av synaptiske hendelser. Statistiske sammenligninger mellom grupper ble gjort med One Way ANOVA-testen (Shapiro-Wilk normalitetstest; lik varianstest) og alle parvise multiple sammenligninger med Holm-Sidak-metoden. Kraften til alle utførte tester var > 0,8 (alfa=0,05). P<0,05 ble tatt som signifikant. Ved feil på normalitetstest eller lik varianstest ble Kruskal-Wallis One Way ANOVA på ranger brukt, med Dunns metode for parvise sammenligninger.

For å beregne antall deltakere (n pasienter=n av celler) bruker vi "The iterative method of Camussi et al., 1995." etter relasjonen der n er antall menneskelige nevroner: n>2sigma^2 (z* alfa/D)^2, der sigma må erstattes med et estimat for samplingsvarians (s^2), alfa=0,05, z*alpha=-2, og D er forskjellen mellom behandlinger. Med denne vurderingen vil 12 pasienter for hver WPI tidligere beskrevet være nødvendig. Totalt vil 60 pasienter være involvert i studien om 5 år.

.