Funktionell studie av hämmande neurotransmission i den mänskliga epileptiska hjärnan.

Projektet presenterar 3 mål:

1. Karakterisering av makroskopiska GABA-A-medierade strömmar framkallade av den specifika agonisten, muscimol, i närvaro av selektiva negativa och positiva allosteriska modulatorer för att identifiera subenhetssammansättningen.
2. Funktionell karakterisering av synaptiska GABA-A-medierade strömmar inspelade från hippocampus och kortikala pyramidala neuroner med hjälp av farmakologiska verktyg.
3. Efter förvärvad kunskap om mål 1) och 2), främja ökningen av hämmande tonus i epileptisk vävnad, vilket ökar GABA-frisättningen från interneuroner till huvudceller, genom stimulering av andra neurotransmittorsystem som finns i hjärnan: kolinerga systemet, serotonerga systemet, och dopaminerga systemet.

Experimentell design:

AIM1 WP1.1: Patch-clamp-inspelningar av helcells-GABA-A-medierade strömmar från pyramidala och interneuroner framkallade av muscimol, som perfuserar skivorna med positiva allosteriska modulatorer som diazepam eller nitrazepam, som är selektiva för apha1/alpha2-subenheter GABA-A innehållande receptorer eller fenobarbital selektivt för alfa4/alfa6-subenheter GABA-A-innehållande receptorer.

WP 1.2: Patch-clamp-inspelningar av helcells-GABA-A-medierade strömmar från pyramidala och interneuroner framkallade av muscimol, som perfuserar skivorna med negativa allosteriska modulatorer såsom BetaCCT, som är selektiv för apha1/alpha2-subenheter GABA-A-innehållande receptorer eller L655 ,708 och Furosemid som är selektiva för alfa4/alfa6-subenheter GABA-A-innehållande receptorer.

AIM2 WP2.1: Patch-clamp-inspelningar av spontana och framkallade GABA-A-synaptiska strömmar från interneuroner och pyramidala celler och deras modulering med samma farmakologiska verktyg som i Mål 1, WP2.2: Patch-clamp-inspelningar av spontana och framkallade glutamatergiska synaptiska ämnen strömmar från interneuroner och pyramidala celler och deras modulering av GABA positiva och negativa allosteriska modulatorer.

AIM3 WP 3.1:Ökning av GABA-frisättning, genom att registrera spontana strömmar i pyramidala neuroner, modulera, med hjälp av allosteriska modulatorer, de kolinerga, dopaminerga och serotonerga receptorerna.

Metoder och statistiska analyser:

Under det neurokirurgiska tillvägagångssättet kommer 1 kub cm av total biopsivävnad att användas för ex-vivo-experiment. Transversala neokortikala eller hippocampala skivor (350 μm tjocklek) kommer att skära i glycerolbaserad artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) med en vibratom (Leica VT 1000S) ) omedelbart efter kirurgisk resektion. Skivorna kommer att placeras i en skivinkubationskammare vid rumstemperatur med syresatt ACSF och överföras till en inspelningskammare inom 1-24 timmar efter skivberedning. Helcells patch-clamp-inspelningar kommer att utföras på pyramidceller eller interneuroner vid 22-25°C.

Både excitatoriska och inhiberande spontana eller miniatyr postsynaptiska strömmar kommer att spelas in med en Multiclamp 700B förstärkare (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), -70 mV hållpotential, i närvaro av TTX, 1 mikroM, CNQX, 20 mikroM och ( AP5, 40 mikroM för att blockera natriumströmmar, AMPA-, kainat- respektive NMDA-receptorer eller i närvaro av bicucullin (20 mikroM) och CGP55845 (50 nM) för att blockera GABA-A- och -B-receptorer vid behov. Patchpipetter kommer att fyllas med den intracellulära lösningen innehållande: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA och 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, med KOH). Ingångs- och serieresistanser kommer att övervakas under experimenten var femte minut, och >10 % förändringar uteslöt cellen från ytterligare analys. GABA-A-receptoragonist eller -antagonist kommer att administreras till cellerna genom perfusion i badlösningen under 10 minuter.

Kemikalier och lösningar. ACSF kommer att ha följande sammansättning: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukos, 0,1 mM Na-pyruvat (pH 7,35). Glycerolbaserad ACSF-lösning kommer att innehålla 250 mM glycerol, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM glukos och 0,1 mM Na-pyruvat (73).

Dataanalys och statistik. Analysen av elektrofysiologiska parametrar kommer att utföras med programvaran Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) med hjälp av en detektionsalgoritm baserad på en glidande mall. För att karakterisera strömmarna kommer den att användas: i) stigtiden (uppskattad som den tid som behövs för 10-90 % ökning av toppströmsvaret); ii) avklingningstiden (som den tid som behövs för 90-10 % minskning av toppströmmen); iii) medelladdningen för en enda synaptisk händelse, Q (mätt som tidsintegralen för strömmarna); vi) amplitud och v) frekvens av synaptiska händelser. Statistiska jämförelser mellan grupper gjordes med One Way ANOVA-testet (Shapiro-Wilk normalitetstest; lika varianstest) och alla parvisa multipla jämförelser med Holm-Sidak-metoden. Effekten av alla utförda tester var > 0,8 (alfa=0,05). P<0,05 togs som signifikant. Vid misslyckande av normalitetstest eller lika varianstest användes Kruskal-Wallis One Way ANOVA på rankningar, med Dunns metod för parvisa jämförelser.

För att beräkna antalet deltagare (n patienter=n av celler) använder vi "The iterative method of Camussi et al., 1995." efter relationen där n är antalet mänskliga neuroner: n>2sigma^2 (z* alfa/D)^2, där sigma måste ersättas med en uppskattning av samplingsvarians (s^2), alfa=0,05, z*alpha=-2, och D är skillnaden mellan behandlingar. Med detta övervägande kommer 12 patienter att behövas för varje WPI som tidigare beskrivits. Totalt kommer 60 patienter att vara involverade i studien om 5 år.

.