Funktionel undersøgelse af hæmmende neurotransmission i den humane epileptiske hjerne.

Projektet præsenterer 3 mål:

1. Karakterisering af makroskopiske GABA-A-medierede strømme fremkaldt af den specifikke agonist, muscimol, i nærvær af selektive negative og positive allosteriske modulatorer for at identificere underenhedssammensætningen.
2. Funktionel karakterisering af synaptiske GABA-A-medierede strømme optaget fra hippocampale og kortikale pyramidale neuroner ved hjælp af farmakologiske værktøjer.
3. Efter den erhvervede viden om mål 1) og 2), fremme af stigningen af ​​inhiberende tonus i epileptisk væv, hvilket øger GABA-frigivelsen fra interneuroner til hovedceller, ved stimulering af andre neurotransmittersystemer til stede i hjernen: kolinergt system, serotonerge system, og dopaminerge system.

Eksperimentelt design:

AIM1 WP1.1: Patch-clamp-optagelser af helcelle-GABA-A-medierede strømme fra pyramidale og interneuroner fremkaldt af muscimol, der perfusionerer skiverne med positive allosteriske modulatorer såsom diazepam eller nitrazepam, der er selektive for apha1/alpha2-underenheder GABA-A indeholdende receptorer eller phenobarbital selektivt for alpha4/alpha6-underenheder GABA-A-holdige receptorer.

WP 1.2: Patch-clamp-optagelser af helcelle-GABA-A-medierede strømme fra pyramidale og interneuroner fremkaldt af muscimol, der perfuserer skiverne med negative allosteriske modulatorer såsom BetaCCT, som er selektiv for apha1/alpha2-underenheder GABA-A-holdige receptorer eller L655 ,708 og Furosemid, der er selektive for alpha4/alpha6-underenheder GABA-A-holdige receptorer.

AIM2 WP2.1: Patch-clamp-optagelser af spontane og fremkaldte GABA-A-synaptiske strømme fra interneuroner og pyramideceller og deres modulering med de samme farmakologiske værktøjer som i Mål 1, WP2.2: Patch-clamp-optagelser af spontane og fremkaldte glutamatergiske synaptiske forbindelser strømme fra interneuroner og pyramideceller og deres modulering af GABA positive og negative allosteriske modulatorer.

AIM3 WP 3.1: Forøgelse af GABA-frigivelse ved at optage spontane strømme i pyramidale neuroner, ved hjælp af allosteriske modulatorer modulere de kolinerge, dopaminerge og serotonerge receptorer.

Metoder og statistiske analyser:

Under den neurokirurgiske tilgang vil 1 kube cm af totalt biopsivæv blive brugt til ex-vivo eksperimenter. Transversale neokortikale eller hippocampale skiver (350 μm tykkelse) vil skære i glycerol-baseret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med et vibratom (Leica VT 1000S) ) umiddelbart efter kirurgisk resektion. Skiver vil blive anbragt i et skive-inkubationskammer ved stuetemperatur med oxygeneret ACSF og overført til et registreringskammer inden for 1-24 timer efter skiveforberedelse. Helcelle patch-clamp-optagelser vil blive udført på pyramideceller eller interneuroner ved 22-25°C.

Både excitatoriske og inhiberende spontane eller miniature postsynaptiske strømme vil blive optaget ved hjælp af en Multiclamp 700B forstærker (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), -70 mV holdepotentiale, i nærvær af TTX, 1 mikroM, CNQX, 20 mikroM og ( AP5, 40 mikroM for at blokere natriumstrømme, henholdsvis AMPA-, kainat- og NMDA-receptorer eller i nærværelse af bicucullin (20 mikroM) og CGP55845 (50 nM) for at blokere GABA-A- og -B-receptorer, når det er nødvendigt. Patch-pipetter vil blive fyldt med den intracellulære opløsning indeholdende: 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA og 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, med KOH). Input- og seriemodstande vil blive overvåget under eksperimenterne hvert femte minut, og >10% ændringer udelukkede cellen fra yderligere analyse. GABA-A-receptoragonist eller -antagonist vil blive administreret til cellerne ved perfusion i badopløsningen i 10 minutter.

Kemikalier og opløsninger. ACSF vil have følgende sammensætning: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, 0,1 mM Na-pyruvat (pH 7,35). Glycerol-baseret ACSF-opløsning vil indeholde 250 mM glycerol, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM glucose og 0,1 mM Na-pyruvat (73).

Dataanalyse og statistik. Analysen af ​​elektrofysiologiske parametre vil blive udført med Clampfit 10 software (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) ved at bruge en detektionsalgoritme baseret på en glidende skabelon. For at karakterisere strømmene vil det blive brugt: i) stigningstiden (estimeret som den nødvendige tid til 10-90 % stigning af spidsstrømsreaktionen); ii) henfaldstiden (som den nødvendige tid til 90-10% reduktion af spidsstrøm); iii) middelladningen af ​​en enkelt synaptisk hændelse, Q (målt som tidsintegralet af strømmene); vi) amplitude og v) hyppighed af synaptiske hændelser. Statistiske sammenligninger mellem grupper blev foretaget med One Way ANOVA-testen (Shapiro-Wilk normalitetstest; lige varianstest) og alle parvise multiple sammenligninger med Holm-Sidak-metoden. Effekten af ​​alle udførte tests var > 0,8 (alfa=0,05). P<0,05 blev taget som signifikant. I tilfælde af svigt af normalitetstest eller lige varianstest blev Kruskal-Wallis One Way ANOVA på ranger anvendt med Dunns metode til parvise sammenligninger.

For at beregne antallet af deltagere (n patienter=n af celler) bruger vi "The iterative method of Camussi et al., 1995." efter relationen, hvor n er antallet af menneskelige neuroner: n>2sigma^2 (z* alfa/D)^2, hvor sigma skal erstattes med et estimat af samplingsvarians (s^2), alfa=0,05, z*alpha=-2, og D er forskellen mellem behandlinger. Med denne betragtning vil det være nødvendigt med 12 patienter for hver WPI tidligere beskrevet. I alt vil 60 patienter være involveret i undersøgelsen om 5 år.

.