Étude fonctionnelle de la neurotransmission inhibitrice dans le cerveau épileptique humain.

Le projet présente 3 objectifs :

1. Caractérisation des courants macroscopiques médiés par le GABA-A évoqués par l'agoniste spécifique, le muscimol, en présence de modulateurs allostériques négatifs et positifs sélectifs pour identifier la composition de la sous-unité.
2. Caractérisation fonctionnelle des courants synaptiques médiés par le GABA-A enregistrés à partir des neurones pyramidaux hippocampiques et corticaux à l'aide d'outils pharmacologiques.
3. Après la connaissance acquise des objectifs 1) et 2), promotion de l'augmentation du tonus inhibiteur dans le tissu épileptique, en favorisant la libération de GABA des interneurones sur les cellules principales, par stimulation d'autres systèmes de neurotransmetteurs présents dans le cerveau : système cholinergique, système sérotoninergique, et système dopaminergique.

Conception expérimentale:

AIM1 WP1.1 : Enregistrements patch-clamp des courants médiés par le GABA-A dans la cellule entière provenant des pyramides et des interneurones évoqués par le muscimol, perfusant les tranches avec des modulateurs allostériques positifs tels que le diazépam ou le nitrazépam, qui sont sélectifs pour les sous-unités apha1/alpha2 GABA-A contenant des récepteurs ou phénobarbital sélectif pour les sous-unités alpha4/alpha6 GABA-A contenant des récepteurs.

WP 1.2 : Enregistrements patch-clamp des courants médiés par le GABA-A dans la cellule entière provenant des pyramides et des interneurones évoqués par le muscimol, perfusant les tranches avec des modulateurs allostériques négatifs tels que BetaCCT, qui est sélectif pour les sous-unités apha1/alpha2 GABA-A contenant des récepteurs ou L655 ,708 et le furosémide qui sont sélectifs pour les sous-unités alpha4/alpha6 GABA-A contenant des récepteurs.

AIM2 WP2.1 : Enregistrements patch-clamp de courants synaptiques GABA-A spontanés et évoqués provenant d'interneurones et de cellules pyramidales et leur modulation par les mêmes outils pharmacologiques que dans l'objectif 1, WP2.2 : Enregistrements patch-clamp de courants synaptiques glutamatergiques spontanés et évoqués les courants des interneurones et des cellules pyramidales et leur modulation par les modulateurs allostériques positifs et négatifs du GABA.

AIM3 WP 3.1 : Augmentation de la libération de GABA, par enregistrement de courants spontanés dans les neurones pyramidaux, modulant, au moyen de modulateurs allostériques, les récepteurs cholinergiques, dopaminergiques et sérotoninergiques.

Méthodologies et analyses statistiques :

Au cours de l'approche neurochirurgicale, 1 cm cube de tissu biopsique total sera utilisé pour des expériences ex-vivo. Des tranches transversales de néocortex ou d'hippocampe (350 μm d'épaisseur) seront coupées dans du liquide céphalo-rachidien artificiel à base de glycérol (ACSF) avec un vibratome (Leica VT 1000S ) immédiatement après la résection chirurgicale. Les tranches seront placées dans une chambre d'incubation de tranches à température ambiante avec ACSF oxygéné et transférées dans une chambre d'enregistrement dans les 1 à 24 h après la préparation des tranches. Des enregistrements patch-clamp de cellules entières seront effectués sur des cellules pyramidales ou des interneurones à 22-25°C.

Les courants post-synaptiques spontanés ou miniatures excitateurs et inhibiteurs seront enregistrés à l'aide d'un amplificateur Multiclamp 700B (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), potentiel de maintien de -70 mV, en présence de TTX, 1 microM, CNQX, 20microM et ( AP5, 40 microM pour bloquer les courants sodium, les récepteurs AMPA, kaïnate et NMDA respectivement ou en présence de bicuculline (20 microM) et CGP55845 (50nM) pour bloquer les récepteurs GABA -A et -B si nécessaire. Les pipettes patch seront remplies avec la solution intracellulaire contenant : 140 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM EGTA et 2 mM Mg-ATP (pH 7,35, avec KOH). Les résistances d'entrée et de série seront surveillées pendant les expériences toutes les cinq minutes, et des changements > 10 % ont exclu la cellule d'une analyse plus approfondie. L'agoniste ou l'antagoniste du récepteur GABA-A sera administré aux cellules par perfusion dans la solution du bain pendant 10 minutes.

Produits chimiques et solutions. ACSF aura la composition suivante : 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, 0,1 mM Na-pyruvate (pH 7,35). La solution ACSF à base de glycérol contiendra 250 mM de glycérol, 2,5 mM de KCl, 2,4 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2, 1,2 mM de NaH2PO4, 26 mM de NaHCO3, 11 mM de glucose et 0,1 mM de Na-pyruvate (pH 7,35).

Analyse des données et statistiques. L'analyse des paramètres électrophysiologiques sera réalisée avec le logiciel Clampfit 10 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) en utilisant un algorithme de détection basé sur un gabarit glissant. Pour caractériser les courants, on utilisera : i) le temps de montée (estimé comme le temps nécessaire pour une augmentation de 10 à 90 % de la réponse en courant de crête) ; ii) le temps de décroissance (comme le temps nécessaire pour une diminution de 90 à 10 % du courant de crête) ; iii) la charge moyenne d'un seul événement synaptique, Q (mesurée comme l'intégrale temporelle des courants); vi) amplitude et v) fréquence des événements synaptiques. Des comparaisons statistiques entre les groupes ont été faites avec le test One Way ANOVA (test de normalité de Shapiro-Wilk ; test de variance égale) et toutes les comparaisons multiples par paires avec la méthode Holm-Sidak. La puissance de tous les tests effectués était > 0,8 (alpha=0,05). P<0,05 a été considéré comme significatif. En cas d'échec du test de normalité ou du test d'égalité de variance, l'ANOVA à un facteur Kruskal-Wallis sur les rangs a été utilisée, avec la méthode de Dunn pour les comparaisons par paires.

Pour calculer le nombre de participants (n patients = n de cellules) nous utilisons "La méthode itérative de Camussi et al., 1995." suivant la relation où n est le nombre de neurones humains : n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2, où sigma doit être remplacé par une estimation de la variance d'échantillonnage (s^2), alpha=0,05, z*alpha=-2, et D est la différence entre les traitements. Avec cette considération, 12 patients pour chaque WPI décrit précédemment seront nécessaires. Au total 60 patients seront impliqués dans l'étude dans 5 ans.

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