人类癫痫脑中抑制性神经传递的功能研究。
从人脑切除的神经组织中抑制性和兴奋性神经传递的功能研究：了解新的分子机制和发现治疗耐药性癫痫的新治疗靶点。
研究概览
详细说明
该项目提出了 3 个目标：
- 由特定激动剂蝇蕈醇诱发的宏观 GABA-A 介导电流的表征，存在选择性负性和正性变构调节剂以确定亚基组成。
- 使用药理学工具从海马和皮质锥体神经元记录的突触 GABA-A 介导电流的功能表征。
- 在获得目标 1) 和 2) 的知识后，通过刺激大脑中存在的其他神经递质系统：胆碱能系统、血清素能系统、和多巴胺能系统。
实验设计：
AIM1 WP1.1：全细胞 GABA-A 介导的锥体和中间神经元电流的膜片钳记录，由 muscimol 诱发，用地西泮或硝西泮等正变构调节剂灌注切片，这些调节剂对 apha1/alpha2 亚基 GABA-A 具有选择性含受体或苯巴比妥对 alpha4/alpha6 亚基具有选择性的 GABA-A 含受体。
WP 1.2：全细胞 GABA-A 介导的锥体和中间神经元电流的膜片钳记录，该电流由蝇蕈醇诱发，用负变构调节剂（例如 BetaCCT）灌注切片，它对含有 GABA-A 的 apha1/alpha2 亚基受体或 L655 具有选择性,708 和呋塞米，它们对含有 alpha4/alpha6 亚基的 GABA-A 受体具有选择性。
AIM2 WP2.1：来自中间神经元和锥体细胞的自发和诱发 GABA-A 突触电流的膜片钳记录及其通过与目标 1 相同的药理学工具进行调节，WP2.2：自发和诱发谷氨酸能突触的膜片钳记录来自中间神经元和锥体细胞的电流及其通过 GABA 正和负变构调节剂的调节。
AIM3 WP 3.1：增加 GABA 释放，通过记录锥体神经元中的自发电流，通过变构调节剂调节胆碱能、多巴胺能和血清素能受体。
方法论和统计分析：
在神经外科方法中，将使用 1 立方厘米的总活检组织进行离体实验。横向新皮质或海马切片（350 μm 厚）将使用振动切片机（Leica VT 1000S）在基于甘油的人工脑脊液（ACSF）中切割) 手术切除后立即。 切片将在室温下与含氧 ACSF 一起放置在切片孵育室中，并在切片制备后 1-24 小时内转移到记录室。 将在 22-25°C 下对锥体细胞或中间神经元进行全细胞膜片钳记录。
使用 Multiclamp 700B 放大器（Axon Instruments，Foster City，CA，USA）记录兴奋性和抑制性自发或微型突触后电流，-70 mV 保持电位，存在 TTX、1 microM、CNQX、20microM 和（ AP5、40microM 分别阻断钠电流、AMPA、红藻氨酸和 NMDA 受体，或在荷包牡丹碱 (20 microM) 和 CGP55845 (50nM) 存在下必要时阻断 GABA -A 和 -B 受体。 贴片吸管将充满细胞内溶液，其中包含：140 mM KCl、10 mM HEPES、0.5 mM EGTA 和 2 mM Mg-ATP（pH 7.35，含 KOH）。 输入电阻和串联电阻将在实验期间每五分钟监测一次，>10% 的变化将电池排除在进一步分析之外。 通过在浴液中灌注 10 分钟，将 GABA-A 受体激动剂或拮抗剂施用于细胞。
化学品和解决方案。 ACSF 将具有以下成分：125 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl2、1.25 mM NaH2PO4、1 mM MgCl2、26 mM NaHCO3、10 mM 葡萄糖、0.1 mM 丙酮酸钠 (pH 7.35)。 基于甘油的 ACSF 溶液将包含 250 mM 甘油、2.5 mM KCl、2.4 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2、1.2 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、11 mM 葡萄糖和 0.1 mM 丙酮酸钠 (pH 7.35)。
数据分析和统计。 电生理参数的分析将通过使用基于滑动模板的检测算法，使用 Clampfit 10 软件（Axon Instruments，Foster City，CA，USA）进行。 要表征电流，将使用：i) 上升时间（估计为峰值电流响应增加 10-90% 所需的时间）； ii) 衰减时间（峰值电流下降90-10%所需的时间）； iii) 单个突触事件的平均电荷 Q（测量为电流的时间积分）； vi) 振幅和 v) 突触事件的频率。 组间统计比较采用单向方差分析检验（Shapiro-Wilk 正态性检验；等方差检验），所有成对多重比较采用 Holm-Sidak 方法。 所有执行测试的功效 > 0.8 (alpha=0.05)。 P<0.05被认为是显着的。 在正态性检验或等方差检验失败的情况下，使用 Kruskal-Wallis One Way ANOVA on ranks，使用 Dunn 方法进行成对比较。
为了计算参与者的数量（n 个患者 = n 个细胞），我们使用“Camussi 等人的迭代方法，1995 年。”遵循以下关系，其中 n 是人类神经元的数量：n>2sigma^2 (z* alpha/D)^2，其中 sigma 必须用抽样方差估计值 (s^2) 代替，alpha=0.05， z*alpha=-2，D为处理间的差异。 考虑到这一点，前面描述的每个 WPI 需要 12 名患者。 5 年内总共将有 60 名患者参与该研究。
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研究类型
注册 (预期的)
联系人和位置
学习联系方式
- 姓名：katiuscia Martinello, Biology
- 电话号码：+39 0865915218
- 邮箱：katiuscia.martinello@neuromed.it
学习地点
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Isernia
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Pozzilli、Isernia、意大利、86090
- 招聘中
- IRCCS INM Neuromed
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接触：
- katiuscia Martinello, Biology
- 电话号码：+39 0865-915218
- 邮箱：Katiuscia.martinello@neuromed.it
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首席研究员：
- katiuscia Martinello, Biology, PhD
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副研究员：
- Patrizia Ratano, Biology, PhD
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副研究员：
- Fucile Sergio, Physics,PhD
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副研究员：
- Limatola Cristina, Biology,PhD
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副研究员：
- Esposito Vincenzo, MD, NCH
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参与标准
资格标准
适合学习的年龄
- 孩子
- 成人
- 年长者
接受健康志愿者
有资格学习的性别
取样方法
研究人群
描述
纳入标准：
耐药性颞叶癫痫患者。
排除标准：
- 患有中风、缺血、海绵状血管瘤或脑膜瘤生长引起的颞叶癫痫患者。
学习计划
研究是如何设计的？
设计细节
- 观测模型：仅案例
- 时间观点：追溯
队列和干预
团体/队列 |
干预/治疗 |
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耐药性癫痫患者
所有接受神经外科手术切除癫痫病灶的耐药性癫痫患者。
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从活检中获得的组织切片的离体实验
其他名称：
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研究衡量的是什么？
主要结果指标
结果测量 |
措施说明 |
大体时间 |
|---|---|---|
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调节宏观电流的 GABA-A 受体的组成
大体时间：24个月
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WP1.1- 从 12 名患者获得的组织切片 治疗：地西泮或硝西泮和苯巴比妥 WP 1.2：- 从 12 名患者获得的组织切片 治疗：BetaCCT 和 L655,708 或速尿。 |
24个月
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GABA-A 受体 PAM 和 NAM 对突触传递的调节
大体时间：24
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WP2.1 取自 12 名患者的组织切片 治疗：地西泮、苯巴比妥、BetcCCt 和速尿，对抑制性突触传递的影响 WP2.2：取自 12 名患者的组织切片 治疗：地西泮、苯巴比妥、BetcCCt 和呋塞米，对兴奋性突触传递的影响 |
24
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胆碱能、多巴胺能和血清素能 PAM 对抑制性突触传递的调节。
大体时间：12
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WP 3.1 从 12 名患者身上获得的组织切片 基于主要结果 1 和 2 治疗中获得的结果：PNU dFBr、mCPGB 或左旋多巴对抑制性神经传递的影响。 |
12
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合作者和调查者
调查人员
- 首席研究员：katiuscia Martinello, Biology、Neuromed IRCCS
研究记录日期
研究主要日期
学习开始 (实际的)
初级完成 (预期的)
研究完成 (预期的)
研究注册日期
首次提交
首先提交符合 QC 标准的
首次发布 (实际的)
研究记录更新
最后更新发布 (实际的)
上次提交的符合 QC 标准的更新
最后验证
更多信息
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