腸内細菌叢組成に対する肥満およびその他の要因の影響

材料および方法

研究デザイン

2019 年 1 月から 2020 年 3 月にかけて、リヤドのキング サウド大学のキャンパスにある応用医科学大学のクリニックで、より大規模な研究が実施されました。 この調査は、その大規模な調査の一部になります。 この研究の主な目的は、胃の微生物叢と肥満マーカーの間に存在する関係の性質を調査することです。 この研究の方法論は、別の場所で詳しく説明されています。 サンプルサイズ 92 は、以前の研究と同様の方法で決定され、有意水準は 5% に設定され、検出力は 80% に設定されました。これは、腸内微生物叢の組成と高等教育を受けたサウジ女性の違いに基づいています。 95% の信頼区間 (CI) と 80% の検出力で、正常体重の女性で 0.9:0.4、肥満の女性で 1.7:1.7 の Firmicutes: Bacteroidetes が期待されます。 また、人々はチラシ、教職員補助、プレゼンテーション、ソーシャル メディアを使用して無作為に登録されました。 次の除外基準を持つ参加者は分析に含まれませんでした: 年齢 18 歳、太りすぎ、体格指数 (BMI) 25-29.9 kg/m2)、妊娠中、特定の食事 (例: カロリー制限食)、過去 8 週間の胃腸疾患の存在、内分泌疾患または腫瘍疾患の病歴、精神疾患、食欲不振、その他の病状の報告、またはマルチビタミン、ビタミンBを使用する.

各参加者には、便のサンプルを研究が行われたのと同じ大学の栄養クリニックに返却する日時と、それまで保管するための容器が与えられました. 参加者は空腹時の血液サンプルを提供し、人口統計学的、栄養学的、および人体測定学的情報を記録しました。 18 歳から 25 歳までの 92 人のサウジ女子学生が最終サンプルを構成し、肥満のあるグループ (BMI 30 kg/m2) (n=44) とそうでないグループ (BMI=18.50-) の 2 つのグループに分けられました。 24.99 kg/m2) (n=48)。 キング サウド大学のキング ハーリド大学病院機関審査委員会委員会は、研究のプロトコル (IRB #E-19-3625) に許可を与えました。

人体測定

被験者の人体測定の測定は、確立されたプロトコルを利用して有資格者によって行われました。 同じ測定を 2 回行い、2 回目の記録の結果を平均して、最終的な調査を行いました。 被験者の身長と体重は、国際標準スケールで測定され、それぞれ 0.10 kg と 0.50 cm 単位で記録されました。 被験者の体重を測定し、0.10 kg 単位で記録しました (Digital Pearson Scale; Oxford, USA)。 個人の BMI を計算するために、体重をキログラム単位で取り、それをメートル単位の身長の 2 乗で割りました。 結果はBMIでした。 世界保健機関 (WHO) は、平均体重を 1 平方メートルあたり 18.50 ～ 24.99 キログラムのボディ マス インデックス (BMI) を持つものとして指定し、肥満体重は 1 平方メートルあたり 30 キログラムを超える BMI を持つものと定義しました。

個人のウエストは伸びないテープで測定し、ヒップ周りも同じテープで測定しました。 腰回りの測定値は、大転子が最大である体の点で測定され、胴囲の測定値は、身体の最も低い肋骨と臍が最も狭い点で測定されました. 両方の測定値は、0.50 cm 以内の精度で取得されました。 ウエストとヒップの比率 (WHR) を計算するために、まずウエストの平均周囲長を取り、それをヒップの平均周囲長で割りました。 次に、結果を次のカテゴリに分類しました: i) 通常の WHR が 0.83 未満、(ii) 0.83 以上 WHR。 生体電気インピーダンス分析 (BIA) アプローチは、体組成、すなわち体脂肪率 (BF%) と筋肉量 (770 BIA; In body, Seoul, South Korea) に関する情報を取得するために利用されました。 カテゴリは次のとおりです。(i) 通常 ≤35%。および (ii) 高い >35% BF%。

食事データ

ガイド付きインタビューの過程で、プロの栄養士が参加者から食事に関する情報を収集しました。 対象者の食物摂取量を評価するために、サウジアラビア食品医薬品局は食​​物頻度アンケート (FFQ) の検証済みバージョンを利用しました。 参加者は、前年中に消費した各食品の量について質問されました。

便分析

採取直後、各糞便サンプルは、空気が漏れず、蓋がしっかりと閉まる容器にすぐに入れられ、-80℃で凍結されました。 その後、材料は研究施設に運ばれ、さらなる調査まで摂氏-80度の冷凍庫に保管されました。 その後、凍結糞便（カタログ：12830-50）0.25gのアリコートからDNAを抽出するためにDNAキットを利用した。 ナノドロップ分光光度計を使用して、抽出されたDNAの濃度とその純度（260対280の比率）を評価しました（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国）。

DNA濃度が1.60以上であることが決定された。 ライブラリーを構築するために、各サンプルには最初に一連の組み合わせデュアル インデックスが割り当てられ、次に合計 12 ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) が行われました。 全ゲノム メタゲノム シーケンス技術は、総細菌 DNA だけでなく、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria、Verrucomicrobia、および Fusobacteria の DNA を識別するために使用されました。 この情報は、主な微生物門のレベルで腸内微生物叢の組成を決定するために、米国の CosmosID に送信されました。

バイオインフォマティクスの方法

アセンブリされていないシーケンス リードは、CosmosID バイオインフォマティクス プラットフォーム (メリーランド州の CosmosID Inc. が所有および運営) によって直接評価されたことが以前に説明されていました。 これは、複数の王国のマイクロバイオームの検査を実施し、抗生物質耐性と毒性の原因となる遺伝子をプロファイリングし、さまざまな生物の相対的存在量を測定するために実施されました。

アルファ多様性 CosmosID 分析でアルファ多様性プロットを作成するために、門、属、種、系統レベルでの存在量スコア行列が使用されました。 Vegan は、チャオ、シンプソン、およびシャノン アルファ (多様性の 3 つの尺度) の計算を可能にする R パッケージです。 R パッケージを使用して、グループを比較する Wilcoxon 順位和検定を実施しました。 R パッケージを使用して、p 値を重ね合わせたプロットを作成しました。

Beta Diversity Principal Coordinate Analyses (PCoA) は、CosmosID から取得した細菌の門、属、種、および株レベルの行列を使用して計算し、β 多様性 PCoA を生成しました。 R のビーガン パッケージの関数を使用してグループ間の Bray-Curtis の非類似性を特定し、ape の PCoA 関数を使用して PCoA テーブルを作成しました。 ビーガンの adonis2 関数を使用して、各距離行列の順列多変量分散分析 (PERMANOVA) テストを生成し、ビーガンの betadisper 関数を使用して、ANOVA メソッドを使用してベータ分散を計算および比較しました。 プロットの生成には R パッケージを使用しました。

統計分析 分析を実行する前に、量的変数の正規性をチェックしました。 変数の正規性は、変数のヒストグラム、Q-Q プロット、および/または変数の歪度と尖度を評価することによってチェックされました。 連続変数と最終結果については、独立標本の t 検定を採用しました。 正規分布パターンに従わなかった変数は、ノンパラメトリック検定を使用して評価されました。 各種類の肉の摂取量の中央値を使用して、人々を高摂取量と低摂取量のカテゴリーに分類し、肉の特定のカットの影響を分離することができました. 非肥満グループでは、白身肉の消費量は、1 人あたりの白身肉の量が 34 グラムを上回っているか下回っているかに基づいて、高白身肉 (HWM) n=32 または低白身肉 (LWM) n=16 に分類されました。 1,000カロリー。 低体重の個人 (n=16) と高体重の個人 (n=28) は、摂取量が 1,000 カロリーあたり 25 グラムのタンパク質の推奨レベル以上であるかどうかに基づいて特定されました.

非肥満グループは、赤身肉の消費量に基づいて、赤身肉（HRM）の摂取量が多い人（n = 21）と赤身肉の摂取量が少ない人（LRM）（n = 27）にさらに分けられました. 肥満集団では、赤身肉の高消費を (HRM、n=14) と定義し、赤身肉の低消費を (LRM、n=30) と定義しました。

肉（全体および種類別）と腸内細菌叢は、ピアソン相関係数を使用して相関しました。 パラメトリック検定を行う前に、すべての非正規変数が変換されました。 推定統計的有意性は、0.05 の p 値と 95% CI を使用して報告されました。 さらに、Benjamini-Hochberg 臨界値は、誤検出率 0.25 で各相関について計算されました。 Windows 用の International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics バージョンが分析に使用されました (バージョン 24; IBM Corp., New York, USA)。

この研究では、CosmosID アプリケーションを使用して、肥満の人々と肥満ではない人々、および体脂肪率とウエストとヒップの比率で層別化された人々の腸内細菌叢を比較し、相関関係があるかどうかを判断しました。彼らが食べた肉の種類と量と肥満の間。 単一のサンプル内の変動に集中して、シャノン検定を使用してアルファ多様性を測定しました。これは、特定のサンプル内の種の存在量の分布を、種の均一性と豊富さに依存する数値として表します。 Bray-Curtis を使用して、ベータ多様性のサンプル間の類似度または非類似度を分析しました。