Einfluss von Adipositas und anderen Faktoren auf die Zusammensetzung der Darmmikrobiota

Materialen und Methoden

Studiendesign

Von Januar 2019 bis März 2020 wurde eine größere Studie in der Klinik des College of Applied Medical Sciences auf dem Campus der King Saud University in Riad durchgeführt. Diese Forschung wird Bestandteil dieser größeren Studie sein. Der Hauptzweck dieser Forschung besteht darin, die Art der Verbindung zu untersuchen, die zwischen der Mikrobiota im Magen und Fettleibigkeitsmarkern besteht. Die Methodik der Studie wird an anderer Stelle ausführlich beschrieben. Die Stichprobengröße von 92 wurde ähnlich wie in einer früheren Studie bestimmt, wobei das Signifikanzniveau auf 5 % und die Aussagekraft auf 80 % festgelegt wurde, basierend auf der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und ihren Unterschieden zwischen saudischen Frauen in der Hochschulbildung. Bei einem Konfidenzintervall (KI) von 95 % und einer Power von 80 % erwarten wir ein Firmicutes: Bacteroidetes-Verhältnis von 0,9:0,4 bei Frauen mit Normalgewicht und 1,7:1,7 bei Frauen mit Adipositas. Außerdem wurden Personen nach dem Zufallsprinzip mithilfe von Flyern, Lehrkräften, Präsentationen und sozialen Medien angeworben. Teilnehmer mit folgenden Ausschlusskriterien wurden nicht in die Analyse aufgenommen: Alter 18 Jahre, Übergewicht, Body-Mass-Index (BMI) 25-29,9 kg/m2), schwanger zu sein, eine bestimmte Diät einzuhalten (z. B. eine kalorienreduzierte Diät), das Vorhandensein von Magen-Darm-Erkrankungen in den letzten acht Wochen, eine Vorgeschichte von endokrinen oder onkologischen Erkrankungen, psychiatrische Störungen, Anorexie, andere Erkrankungen zu melden , oder mit Multivitaminen, Vitamin B.

Jeder Teilnehmer erhielt eine Uhrzeit und ein Datum, an dem er eine Stuhlprobe an die Ernährungsklinik desselben Colleges, an dem die Studie durchgeführt wurde, zurücksenden sollte, zusammen mit einem Behälter, in dem er bis zu diesem Zeitpunkt aufbewahrt werden sollte. Die Teilnehmer stellten nüchterne Blutproben zur Verfügung und ließen ihre demografischen, ernährungsphysiologischen und anthropometrischen Informationen aufzeichnen. 92 saudische Studentinnen im Alter zwischen 18 und 25 bildeten die endgültige Stichprobe und wurden in zwei Gruppen eingeteilt: diejenigen mit Adipositas (BMI 30 kg/m2) (n=44) und diejenigen ohne (BMI=18,50- 24.99 kg/m2) (n=48). Das Institutional Review Board Committee des King Khalid University Hospital der King Saud University erteilte seine Zustimmung zum Protokoll der Studie (IRB #E-19-3625).

Anthropometrische Messungen

Messungen der Anthropometrie des Probanden wurden von qualifiziertem Personal unter Verwendung etablierter Protokolle durchgeführt. Dieselben Messungen wurden zweimal durchgeführt, und die Ergebnisse der zweiten Aufzeichnung wurden für die abschließende Studie gemittelt. Die Größe und das Gewicht des Probanden wurden auf einer internationalen Standardskala gemessen und auf 0,10 kg bzw. 0,50 cm genau dokumentiert. Das Gewicht des Probanden wurde auf 0,10 kg genau bestimmt und dokumentiert (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). Um den BMI einer Person zu berechnen, haben wir ihr Gewicht in Kilogramm genommen und es durch das Quadrat ihrer Körpergröße in Metern geteilt. Das Ergebnis war der BMI. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) definierte das Durchschnittsgewicht mit einem Body-Mass-Index (BMI) zwischen 18,50 und 24,99 Kilogramm pro Quadratmeter, während Fettleibigkeit mit einem BMI von mehr als 30 Kilogramm pro Quadratmeter definiert wurde.

Die Taille der Person wurde mit einem Maßband gemessen, das sich nicht dehnte, und ihr Hüftumfang wurde ebenfalls mit dem gleichen Maßband gemessen. Der Hüftumfang wurde an der Stelle gemessen, an der der große Trochanter am größten war, während der Taillenumfang an der Stelle am Körper gemessen wurde, an der die unterste Rippe und der Nabel am schmalsten waren. Beide Messungen wurden mit einer Genauigkeit von 0,50 cm durchgeführt. Um das Waist-Hip-Ratio (WHR) zu berechnen, haben wir zunächst den durchschnittlichen Taillenumfang genommen und durch den durchschnittlichen Hüftumfang dividiert. Die Ergebnisse wurden dann in die folgenden Kategorien sortiert: i) ein normaler WHR von weniger als 0,83 und (ii) hoch ≥ 0,83 WHR. Der Ansatz der bioelektrischen Impedanzanalyse (BIA) wurde verwendet, um Informationen über die eigene Körperzusammensetzung zu erhalten, nämlich ihren Körperfettanteil (BF%) und ihre Muskelmasse (770 BIA; In body, Seoul, Südkorea). Die Kategorien sind wie folgt: (i) normal ≤35 %; und (ii) hoch > 35 % BF %.

Ernährungsdaten

Während eines geführten Interviews sammelten professionelle Ernährungsberater Ernährungsinformationen von den Teilnehmern. Um die Nahrungsaufnahme der Probanden zu bewerten, wurde eine validierte Version des Food Frequency Questionnaire (FFQ) von der Saudi Food and Drug Authority verwendet. Die Teilnehmer wurden nach der Menge jedes Lebensmittels befragt, das sie im Laufe des vergangenen Jahres konsumiert hatten.

Stuhlanalyse

Unmittelbar nach der Entnahme wurde jede Stuhlprobe sofort in Behälter gegeben, die keine Luft austreten lassen konnten und fest sitzende Deckel hatten, bevor sie bei -80 Grad Celsius eingefroren wurden. Danach wurden die Materialien in die Forschungseinrichtung transportiert, wo sie bis zur weiteren Untersuchung in einem Gefrierschrank bei einer Temperatur von -80 Grad Celsius aufbewahrt wurden. Danach wurde das DNA-Kit verwendet, um DNA aus Aliquots von 0,25 g gefrorenem Kot zu extrahieren (Katalog: 12830-50). Wir verwendeten ein Nanotropfen-Spektrophotometer, um die Konzentration der extrahierten DNA sowie ihre Reinheit (das Verhältnis von 260 zu 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) zu bestimmen.

Es wurde festgestellt, dass die DNA-Konzentration entweder größer oder gleich 1,60 war. Um Bibliotheken zu konstruieren, wurde jeder Probe zunächst ein Satz kombinatorischer dualer Indizes zugewiesen, und dann durchlief sie insgesamt 12 Runden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die metagenomische Sequenzierungstechnik des gesamten Genoms wurde verwendet, um die gesamte bakterielle DNA sowie die DNA von Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia und Fusobacteria zu identifizieren. Diese Informationen wurden dann an CosmosID in den Vereinigten Staaten gesendet, um die Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf der Ebene der wichtigsten mikrobiellen Phyla zu bestimmen.

Bioinformatische Methoden

Es wurde zuvor beschrieben, dass die unassemblierten Sequenzierungs-Reads direkt von der CosmosID-Bioinformatikplattform (die CosmosID Inc. in Maryland gehört und von CosmosID Inc. in Maryland betrieben wird) ausgewertet wurden. Dies wurde durchgeführt, um das Mikrobiom mehrerer Königreiche zu untersuchen, die Gene zu profilieren, die für Antibiotikaresistenz und Virulenz verantwortlich sind, und die relative Häufigkeit verschiedener Organismen zu messen.

Alpha-Diversität Die Abundanz-Score-Matrizen auf Phylum-, Gattungs-, Art- und Stammebene wurden verwendet, um Diagramme der Alpha-Diversität in der CosmosID-Analyse zu erstellen. Vegan ist ein R-Paket, das die Berechnung von Chao, Simpson und Shannon Alpha ermöglicht, drei Diversitätsmaße. Unter Verwendung des R-Pakets haben wir Wilcoxon-Rank-Sum-Tests zum Vergleich der Gruppen durchgeführt. Das R-Paket wurde verwendet, um Diagramme mit p-Wert-Überlagerung zu erstellen.

Beta-Diversitäts-Hauptkoordinatenanalysen (PCoA) wurden unter Verwendung von Matrizen auf Stamm-, Gattungs-, Arten- und Stammebene für Bakterien berechnet, die von CosmosID erhalten wurden, um Beta-Diversitäts-PCoAs zu erzeugen. Die Funktion des veganen Pakets von R wurde verwendet, um die Bray-Curtis-Unähnlichkeit zwischen Gruppen zu bestimmen, während die PCoA-Funktion von Affen verwendet wurde, um PCoA-Tabellen zu erstellen. Die Adonis2-Funktion von Vegan wurde verwendet, um Tests zur permutationsmultivariaten Varianzanalyse (PERMANOVA) für jede Distanzmatrix zu generieren, und die Betadisper-Funktion von Vegan wurde verwendet, um die Beta-Dispersion unter Verwendung der ANOVA-Methode zu berechnen und zu vergleichen. Das R-Paket wurde verwendet, um die Plots zu erzeugen.

Statistische Analyse Die Normalität der quantitativen Variablen wurde überprüft, bevor die Analyse durchgeführt wurde. Die Normalität der Variablen wurde überprüft, indem ihre Histogramme, Q-Q-Diagramme und/oder ihre Schiefe und Kurtosis untersucht wurden. Für kontinuierliche Variablen und Endergebnisse haben wir den t-Test für unabhängige Stichproben verwendet. Diejenigen Variablen, die keinem normalen Verteilungsmuster folgten, wurden mit nichtparametrischen Tests bewertet. Die mittlere Aufnahme jeder Fleischsorte wurde verwendet, um Menschen in Kategorien mit hoher und niedriger Aufnahme einzuteilen, was es uns ermöglichte, die Auswirkungen bestimmter Fleischstücke zu isolieren. In der nicht fettleibigen Gruppe wurde der Konsum von weißem Fleisch als „High White Meat“ (HWM), n = 32, oder „Low White Meat“ (LWM), n = 16, kategorisiert, je nachdem, ob der Verzehr von weißem Fleisch über oder unter 34 Gramm pro Person lag 1.000 Kalorien. Personen mit niedrigem Gewicht (n=16) und Personen mit hohem Gewicht (n=28) wurden basierend darauf identifiziert, ob ihre Aufnahme bei oder über der empfohlenen Menge von 25 Gramm Protein pro 1.000 Kalorien lag oder nicht.

Die nicht fettleibige Gruppe wurde weiter unterteilt in diejenigen mit einer hohen Aufnahme von rotem Fleisch (HRM), n = 21, und diejenigen mit einer niedrigen Aufnahme von rotem Fleisch (LRM), n = 27, basierend auf ihrem Verzehr von rotem Fleisch. Bei der fettleibigen Bevölkerung wurde ein hoher Verzehr von rotem Fleisch als (HRM, n=14) und ein niedriger Verzehr von rotem Fleisch als (LRM, n=30) definiert.

Fleisch (gesamt und nach Art) und Darmflora wurden mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten korreliert. Bevor irgendwelche parametrischen Tests durchgeführt wurden, wurde jede nicht-normale Variable transformiert. Die geschätzte statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines p-Werts von 0,05 und eines 95 %-KI angegeben. Außerdem wurde der kritische Benjamini-Hochberg-Wert für jede Korrelation mit einer Falschentdeckungsrate von 0,25 berechnet. Für die Analyse wurde das International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics Version für Windows verwendet (Version 24; IBM Corp., New York, USA).

Diese Studie verwendete die CosmosID-Anwendung, um die Darmmikrobiota von fettleibigen und nicht fettleibigen Menschen sowie von Menschen, die nach ihrem Körperfettanteil und dem Verhältnis von Taille zu Hüfte stratifiziert wurden, zu vergleichen, um festzustellen, ob es eine Korrelation gab zwischen den Arten und Mengen von Fleisch, die sie aßen, und ihrer Fettleibigkeit. Wir konzentrierten uns auf die Variation innerhalb einer einzelnen Probe und verwendeten den Shannon-Test, um die Alpha-Diversität zu messen, die die Verteilung der Artenhäufigkeit in einer bestimmten Probe als eine Zahl darstellt, die von der Gleichmäßigkeit und dem Artenreichtum abhängt. Bray-Curtis wurde verwendet, um den Grad der Ähnlichkeit oder Unähnlichkeit zwischen Proben auf Beta-Diversität zu analysieren.