Wpływ otyłości i innych czynników na skład mikroflory jelitowej

Materiały i metody

Projekt badania

Od stycznia 2019 r. do marca 2020 r. przeprowadzono większe badanie w klinice College of Applied Medical Sciences znajdującej się na kampusie Uniwersytetu Króla Sauda w Rijadzie. Badania te będą częścią tego większego badania. Głównym celem tych badań jest zbadanie natury związku istniejącego między mikrobiomem żołądka a markerami otyłości. Metodologia badania została szczegółowo opisana w innym miejscu. Wielkość próby 92 została określona w sposób podobny do wcześniejszego badania, z poziomem istotności ustalonym na 5% i mocą ustaloną na 80%, w oparciu o skład mikroflory jelitowej i jej różnice między saudyjskimi kobietami z wyższym wykształceniem. Przy 95% przedziale ufności (CI) i 80% mocy oczekujemy, że Firmicutes: Bacteroidetes będzie wynosił 0,9:0,4 u kobiet o prawidłowej masie ciała i 1,7:1,7 u kobiet z otyłością. Ponadto osoby rekrutowano losowo za pomocą ulotek, pomocy wykładowców, prezentacji i mediów społecznościowych. Do analizy nie zostali włączeni uczestnicy spełniający następujące kryteria wykluczające: wiek 18 lat, nadwaga, wskaźnik masy ciała (BMI) 25-29,9 kg/m2), ciąża, przestrzeganie określonej diety (np. dieta niskokaloryczna), zgłaszanie chorób przewodu pokarmowego w ciągu ostatnich ośmiu tygodni, choroby endokrynologiczne lub onkologiczne w wywiadzie, zaburzenia psychiczne, anoreksja, inne schorzenia lub stosując multiwitaminy, witaminę B.

Każdemu uczestnikowi podano godzinę i datę zwrotu próbki kału do kliniki żywieniowej w tej samej uczelni, w której przeprowadzono badanie, wraz z pojemnikiem, w którym miał go przechowywać do tego czasu. Uczestnicy dostarczali próbki krwi na czczo i rejestrowali informacje demograficzne, żywieniowe i antropometryczne. Dziewięćdziesiąt dwie studentki z Arabii Saudyjskiej w wieku od 18 do 25 lat stanowiły ostateczną próbę, którą podzielono na dwie grupy: z otyłością (BMI 30 kg/m2) (n=44) i bez (BMI=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). Komitet Komisji Rewizyjnej Instytucjonalnego Szpitala Uniwersyteckiego Króla Khalida przy Uniwersytecie Króla Sauda wydał zgodę na protokół badania (IRB nr E-19-3625).

Pomiary antropometryczne

Pomiary antropometrii podmiotu zostały wykonane przez wykwalifikowany personel z wykorzystaniem ustalonych protokołów. Te same pomiary wykonano dwukrotnie, a wyniki z drugiego zapisu uśredniono do końcowego badania. Wzrost i wagę badanego zmierzono na międzynarodowej skali standardowej i udokumentowano odpowiednio z dokładnością do 0,10 kg i 0,50 cm. Masę ciała badanego określono i udokumentowano z dokładnością do 0,10 kg (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). Aby obliczyć BMI danej osoby, wzięliśmy jej wagę w kilogramach i podzieliliśmy ją przez kwadrat jej wzrostu w metrach. Wynikiem było BMI. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) określiła średnią wagę jako wskaźnik masy ciała (BMI) między 18,50 a 24,99 kilogramów na metr kwadratowy, podczas gdy otyłość została zdefiniowana jako BMI powyżej 30 kilogramów na metr kwadratowy.

Talię osoby mierzono za pomocą taśmy, która się nie rozciągała, a także obwód bioder za pomocą tej samej taśmy. Pomiaru obwodu bioder dokonywano w miejscu największego położenia krętarza wielkiego, natomiast obwodu talii w miejscu najwęższym najniższego żebra i pępka. Oba pomiary uzyskano z dokładnością do 0,50 centymetra. Aby obliczyć stosunek talii do bioder (WHR), najpierw podzieliliśmy średni obwód talii przez średni obwód bioder. Wyniki następnie podzielono na następujące kategorie: i) normalny WHR poniżej 0,83 oraz (ii) wysoki ≥0,83 WHR. Metoda analizy impedancji bioelektrycznej (BIA) została wykorzystana w celu uzyskania informacji dotyczących składu ciała, a mianowicie procentowej zawartości tkanki tłuszczowej (BF%) i masy mięśniowej (770 BIA; In body, Seul, Korea Południowa). Kategorie są następujące: (i) normalny ≤35%; oraz (ii) Wysoka >35% BF%.

Dane dietetyczne

W trakcie wywiadu z przewodnikiem profesjonalni dietetycy zebrali informacje żywieniowe od uczestników. Aby ocenić spożycie pokarmu przez badanych, saudyjski Urząd ds. Żywności i Leków wykorzystał zwalidowaną wersję Kwestionariusza Częstotliwości Żywności (FFQ). Uczestnicy zostali zapytani o ilość każdego produktu spożywczego, który spożyli w ciągu poprzedniego roku.

Analiza stolca

Natychmiast po pobraniu każdą próbkę kału umieszczono w pojemnikach, które nie przepuszczały powietrza i miały dobrze dopasowane pokrywki przed zamrożeniem w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Następnie materiały przetransportowano do ośrodka badawczego, gdzie do czasu dalszych badań przechowywano je w zamrażarce w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Następnie DNA Kit został wykorzystany do ekstrakcji DNA z porcji 0,25 g zamrożonego kału (Katalog: 12830-50). Użyliśmy spektrofotometru Nano-drop do oceny stężenia wyekstrahowanego DNA, jak również jego czystości (stosunek 260 do 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

Stwierdzono, że stężenie DNA było większe lub równe 1,60. W celu skonstruowania bibliotek każdej próbce najpierw przypisano zestaw kombinatorycznych podwójnych indeksów, a następnie przeszła łącznie 12 rund reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Metodę sekwencjonowania metagenomicznego całego genomu zastosowano do identyfikacji całkowitego DNA bakterii, jak również DNA Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia i Fusobacteria. Informacje te zostały następnie przesłane do CosmosID w Stanach Zjednoczonych w celu określenia składu mikroflory jelitowej na poziomie głównych typów mikroorganizmów.

Metody bioinformatyczne

Opisano wcześniej, że niezmontowane odczyty sekwencjonowania zostały bezpośrednio ocenione przez platformę bioinformatyczną CosmosID (która jest własnością i jest obsługiwana przez CosmosID Inc. w Maryland). Przeprowadzono to w celu zbadania mikrobiomu wielu królestw, profilowania genów odpowiedzialnych za oporność na antybiotyki i zjadliwość oraz zmierzenia względnej liczebności różnych organizmów.

Różnorodność alfa Macierze wyników liczebności na poziomach typu, rodzaju, gatunku i szczepu zostały użyte do stworzenia wykresów różnorodności alfa w analizie CosmosID. Vegan to pakiet R, który pozwala na obliczenie Chao, Simpsona i Shannona alfa, trzech miar różnorodności. Korzystając z pakietu R, przeprowadziliśmy testy Wilcoxona Rank-Sum porównujące grupy. Pakiet R został wykorzystany do utworzenia wykresów z nakładką wartości p.

Analizy głównych współrzędnych różnorodności beta (PCoA) obliczono przy użyciu macierzy typu, rodzaju, gatunku i poziomu szczepu dla bakterii uzyskanych z CosmosID w celu wygenerowania PCoA różnorodności beta. Funkcja pakietu wegańskiego R została wykorzystana do określenia odmienności Braya-Curtisa między grupami, podczas gdy funkcja PCoA małpy została wykorzystana do skonstruowania tabel PCoA. Funkcja adonis2 Vegana została wykorzystana do wygenerowania testów permutacyjnej wielowymiarowej analizy wariancji (PERMANOVA) dla każdej macierzy odległości, a funkcja betadisper wegan została wykorzystana do obliczenia i porównania dyspersji beta przy użyciu metody ANOVA. Do wygenerowania wykresów użyto pakietu R.

Analiza statystyczna Normalność zmiennych ilościowych została sprawdzona przed wykonaniem analizy. Normalność zmiennych sprawdzano sprawdzając ich histogramy, wykresy Q-Q i/lub oceniając ich skośność i kurtozę. W przypadku zmiennych ciągłych i wyników końcowych zastosowaliśmy test t dla próbek niezależnych. Te zmienne, które nie miały rozkładu normalnego, zostały ocenione za pomocą testów nieparametrycznych. Mediana spożycia każdego rodzaju mięsa została wykorzystana do sklasyfikowania ludzi na kategorie o wysokim i niskim spożyciu, co pozwoliło nam wyizolować wpływ określonych kawałków mięsa. W grupie osób nieotyłych spożycie białego mięsa zostało sklasyfikowane jako wysokie spożycie białego mięsa (HWM), n=32 lub niskie spożycie białego mięsa (LWM), n=16, w zależności od tego, czy było powyżej, czy poniżej 34 gramów białego mięsa na 1000 kalorii. Osoby o niskiej masie ciała (n=16) i osoby o wysokiej masie ciała (n=28) zostały zidentyfikowane na podstawie tego, czy ich spożycie było równe lub przekraczało zalecany poziom 25 gramów białka na 1000 kalorii.

Grupę bez otyłości podzielono dalej na osoby o wysokim spożyciu czerwonego mięsa (HRM), n=21 i te o niskim spożyciu czerwonego mięsa (LRM), n=27 na podstawie spożycia czerwonego mięsa. W populacji osób otyłych wysokie spożycie czerwonego mięsa zdefiniowano jako (HRM, n=14), a niskie spożycie czerwonego mięsa zdefiniowano jako (LRM, n=30).

Mięso (ogółem i rodzajowo) oraz florę jelitową skorelowano za pomocą współczynnika korelacji Pearsona. Przed wykonaniem jakichkolwiek testów parametrycznych każdą zmienną nienormalną poddano transformacji. Szacowaną istotność statystyczną podano przy użyciu wartości p 0,05 i 95% przedziału ufności. Ponadto dla każdej korelacji obliczono wartość krytyczną Benjaminiego-Hochberga przy współczynniku fałszywych odkryć wynoszącym 0,25. Do analizy wykorzystano pakiet statystyczny International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics dla systemu Windows (wersja 24; IBM Corp., Nowy Jork, USA).

W tym badaniu wykorzystano aplikację CosmosID do porównania mikroflory jelitowej osób otyłych i zdrowych, a także tych, które zostały podzielone według procentu tkanki tłuszczowej i stosunku talii do bioder, aby określić, czy istnieje korelacja pomiędzy rodzajem i ilością spożywanego mięsa a otyłością. Koncentrując się na zmienności w pojedynczej próbce, zastosowaliśmy test Shannona do pomiaru różnorodności alfa, który przedstawia rozkład obfitości gatunków w określonej próbce jako liczbę zależną od równości i bogactwa gatunków. Bray-Curtis został użyty do analizy stopnia podobieństwa lub odmienności między próbkami pod kątem różnorodności beta.