肥胖和其他因素对肠道菌群组成的影响

材料和方法

学习规划

从 2019 年 1 月到 2020 年 3 月，一项更大的研究在位于利雅得沙特国王大学校园内的应用医学学院诊所进行。 这项研究将成为那项更大规模研究的组成部分。 这项研究的主要目的是调查胃中微生物群与肥胖标志物之间存在的联系的性质。 该研究的方法在别处有详细描述。 样本量 92 的确定方式与之前的研究类似，显着性水平设定为 5%，功效设定为 80%，这是基于肠道微生物群的组成及其在接受高等教育的沙特女性中的差异。 凭借 95% 的置信区间 (CI) 和 80% 的功效，我们预计正常体重女性的厚壁菌门：拟杆菌门为 0.9:0.4，肥胖女性为 1.7:1.7。 此外，人们是通过传单、教师援助、演示文稿和社交媒体随机招募的。 具有以下排除标准的参与者未包括在分析中：年龄 18 岁、超重、体重指数 (BMI) 25-29.9 kg/m2）、怀孕、遵循特定饮食（例如，限制卡路里的饮食）、报告过去八周内存在胃肠道疾病、内分泌或肿瘤病史、精神障碍、厌食症、其他医疗状况，或使用复合维生素、维生素 B。

每个参与者都有一个时间和日期，将粪便样本返回到进行研究的同一所大学的营养诊所，并附上一个容器，以便在该时间之前将其储存在其中。 参与者提供了空腹血样，并记录了他们的人口统计、营养和人体测量信息。 92 名年龄在 18 至 25 岁之间的沙特女学生构成了最终样本，她们被分为两组：肥胖者（BMI 30 kg/m2）（n=44）和非肥胖者（BMI=18.50- 24.99 公斤/平方米）（n=48）。 沙特国王大学哈立德国王大学医院机构审查委员会批准了该研究的方案 (IRB #E-19-3625)。

人体测量

对象的人体测量学测量由合格人员利用既定协议进行。 两次进行相同的测量，第二次记录的结果取平均值用于最终研究。 受试者的身高和体重是根据国际标准量表测量的，并分别记录到最接近的 0.10 千克和 0.50 厘米。 确定受试者的体重并记录为最接近的 0.10 千克（数字皮尔逊量表；美国牛津）。 为了计算一个人的 BMI，我们用他们的体重（公斤）除以他们身高（米）的平方。 结果是 BMI。 世界卫生组织 (WHO) 将平均体重定义为体重指数 (BMI) 在每平方米 18.50 至 24.99 公斤之间，而肥胖体重则定义为体重指数 (BMI) 超过每平方米 30 公斤。

个人的腰围是用不拉伸的卷尺测量的，他们的臀围也是用同样的卷尺测量的。 臀围的测量是在身体大转子最大的位置进行的，而腰围的测量是在身体最低肋骨和脐部最窄的位置进行的。 两次测量的精度都在 0.50 厘米以内。 为了计算腰臀比 (WHR)，我们首先用平均腰围除以平均臀围。 然后将结果分为以下类别：i) 正常 WHR 小于 0.83 和 (ii) 高 ≥0.83 余热。 使用生物电阻抗分析 (BIA) 方法来获取有关一个人的身体成分的信息，即他们的身体脂肪百分比 (BF%) 和他们的肌肉质量（770 BIA；In body，首尔，韩国）。 类别如下： (i) 正常≤35%； (ii) 高 >35% BF%。

膳食数据

在引导访谈过程中，专业营养师收集了参与者的饮食信息。 为了评估受试者的食物摄入量，沙特食品和药物管理局使用了经过验证的食物频率问卷 (FFQ)。 参与者被问及他们在过去一年中消耗的每种食物的数量。

粪便分析

收集后，每个粪便样本立即放入不能漏气且盖子牢固的容器中，然后在 -80 摄氏度下冷冻。 之后，这些材料被运送到研究设施，在那里它们被保存在-80摄氏度的冰箱中，直到进一步检查。 之后，使用 DNA 试剂盒从 0.25 g 冷冻粪便（目录：12830-50）等分试样中提取 DNA。 我们使用 Nano-drop 分光光度计来评估提取的 DNA 的浓度及其纯度（260 与 280 的比率）（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）。

确定 DNA 浓度大于或等于 1.60。 为了构建文库，每个样本首先被分配一组组合双标签，然后经过总共12轮聚合酶链反应（PCR）。 全基因组宏基因组测序技术用于鉴定细菌总DNA以及厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、疣微菌门和梭杆菌门的DNA。 这些信息随后被发送到美国的 CosmosID，以便在主要微生物门的水平上确定肠道微生物群的组成。

生物信息学方法

之前描述了未组装的测序读数直接由 CosmosID 生物信息学平台（由马里兰州的 CosmosID Inc. 拥有和运营）进行评估。 这样做是为了对多个王国的微生物组进行检查，分析导致抗生素耐药性和毒力的基因，并测量各种生物的相对丰度。

Alpha 多样性 在 CosmosID 分析中，使用门、属、种和品系水平的丰度得分矩阵来创建 alpha 多样性图。 Vegan 是一个 R 包，它允许计算 Chao、Simpson 和 Shannon alpha，三种多样性度量。 使用 R 包，我们对各组进行了 Wilcoxon 秩和检验比较。 R 包用于创建具有 p 值叠加的图。

使用从 CosmosID 获得的细菌的门、属、种和菌株水平矩阵计算 Beta 多样性主坐标分析 (PCoA)，以生成 Beta 多样性 PCoA。 R 的 vegan 包的函数用于确定组间的 Bray-Curtis 差异，而 ape 的 PCoA 函数用于构建 PCoA 表。 Vegan 的 adonis2 函数用于为每个距离矩阵生成置换多变量方差分析 (PERMANOVA) 测试，而 vegan 的 betadisper 函数用于使用 ANOVA 方法计算和比较 beta 离散度。 R 包用于生成绘图。

统计分析 在进行分析之前检查定量变量的正态性。 通过检查其直方图、Q-Q 图和/或评估其偏度和峰度来检查变量的正态性。 对于连续变量和最终结果，我们采用独立样本 t 检验。 那些不遵循正态分布模式的变量使用非参数测试进行评估。 每种肉类的摄入量中位数用于将人们分为高摄入量和低摄入量类别，使我们能够隔离特定肉类切割的影响。 在非肥胖组中，白肉消费量分为高白肉 (HWM)，n=32 或低白肉 (LWM)，n=16，具体取决于每人摄入的白肉是高于还是低于 34 克1,000 卡路里。 低体重个体 (n=16) 和高体重个体 (n=28) 根据他们的摄入量是否达到或超过每 1,000 卡路里摄入 25 克蛋白质的推荐水平来确定。

根据红肉摄入量，非肥胖组进一步分为红肉摄入量高 (HRM) 的人群，n=21 和红肉摄入量低的人群 (LRM)，n=27。 在肥胖人群中，高红肉消费定义为（HRM，n=14），低红肉消费定义为（LRM，n=30）。

使用 Pearson 相关系数将肉类（总量和种类）和肠道菌群相关联。 在进行任何参数测试之前，每个非正态变量都进行了转换。 使用 0.05 的 p 值和 95% CI 报告估计的统计显着性。 此外，以 0.25 的错误发现率计算每个相关性的 Benjamini-Hochberg 临界值。 用于 Windows 的国际商业机器 (IBM) 社会科学统计软件包 (SPSS) Statistics 版本用于分析（版本 24；IBM Corp.，纽约，美国）。

这项研究使用 CosmosID 应用程序比较肥胖者和非肥胖者的肠道菌群，以及根据体脂百分比和腰臀比分层的人群，以确定是否存在相关性他们吃的肉的种类和数量与肥胖之间的关系。 专注于单个样本内的变异，我们采用香农检验来测量 alpha 多样性，它将特定样本中物种丰度的分布描述为取决于物种均匀度和丰富度的数字。 Bray-Curtis 用于分析样本之间的相似度或相异度的 beta 多样性。