Lihavuuden ja muiden tekijöiden vaikutus suolen mikrobiston koostumukseen

Materiaalit ja menetelmät

Opintojen suunnittelu

Tammikuusta 2019 maaliskuuhun 2020 suoritettiin suurempi tutkimus College of Applied Medical Sciences -klinikalla, joka sijaitsee King Saud -yliopiston kampuksella Riadissa. Tämä tutkimus tulee olemaan osa tätä laajempaa tutkimusta. Tämän tutkimuksen ensisijaisena tarkoituksena on selvittää mahalaukun mikrobiotan ja liikalihavuusmerkkien välisen yhteyden luonnetta. Tutkimuksen metodologia on kuvattu tarkemmin muualla. Otoskoko 92 määritettiin samalla tavalla kuin aikaisemmassa tutkimuksessa merkitsevyystasoksi 5 % ja tehoksi 80 % perustuen suoliston mikrobiotan koostumukseen ja sen eroihin korkeakoulutuksessa olevien saudiarabialaisten naisten välillä. 95 %:n luottamusvälillä (CI) ja 80 %:n teholla odotamme Firmicutes: Bacteroidetes -määriä 0,9:0,4 normaalipainoisilla naisilla ja 1,7:1,7 lihavilla naisilla. Myös ihmisiä otettiin mukaan satunnaisesti lentolehtisten, tiedekunnan apuvälineiden, esitelmien ja sosiaalisen median avulla. Osallistujia, joilla oli seuraavat poissulkevat kriteerit, ei otettu mukaan analyysiin: ikä 18 vuotta, ylipaino, painoindeksi (BMI) 25-29,9 kg/m2), olet raskaana, noudattaa tiettyä ruokavaliota (esim. vähäkalorista ruokavaliota), raportoi maha-suolikanavan sairauksista viimeisen kahdeksan viikon aikana, anamneesissa endokriiniset tai onkologiset sairaudet, psykiatriset häiriöt, anoreksia, muut sairaudet tai käyttämällä monivitamiineja, B-vitamiinia.

Jokaiselle osallistujalle annettiin aika ja päivämäärä palauttaa ulostenäyte ravitsemusklinikalle samassa korkeakoulussa, jossa tutkimus suoritettiin, sekä astia, jossa se säilytettiin siihen asti. Osallistujat toimittivat paastoverinäytteitä ja kirjasivat demografiset, ravitsemus- ja antropometriset tiedot. Lopulliseen otokseen muodostui yhdeksänkymmentäkaksi 18–25-vuotiasta saudiarabialaista naisopiskelijaa, jotka jaettiin kahteen ryhmään: liikalihaviin (BMI 30 kg/m2) (n=44) ja ilman (BMI=18,50-) 24.99 kg/m2) (n = 48). King Khalid University Hospitalin instituutioiden arviointilautakunta King Saud Universityn komitea antoi hyväksyntänsä tutkimuksen protokollalle (IRB #E-19-3625).

Antropometriset mittaukset

Koehenkilön antropometrian mittaukset suoritti pätevä henkilöstö käyttäen vakiintuneita protokollia. Samat mittaukset tehtiin kahdesti, ja toisen tallennuksen tuloksista laskettiin keskiarvo loppututkimukseen. Koehenkilön pituus ja paino mitattiin kansainvälisellä standardiasteikolla ja dokumentoitiin 0,10 kg:n ja 0,50 cm:n tarkkuudella. Kohteen paino määritettiin ja dokumentoitiin 0,10 kg:n tarkkuudella (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). Yksilön BMI:n laskemiseksi otimme hänen painonsa kilogrammoina ja jaoimme sen metreissä mitatun pituuden neliöllä. Tuloksena oli BMI. Maailman terveysjärjestö (WHO) määritteli keskimääräiseksi painoksi, jonka painoindeksi (BMI) on 18,50-24,99 kiloa neliömetriä kohti, kun taas lihavan painon määriteltiin BMI:ksi yli 30 kiloa neliömetriä kohti.

Henkilön vyötärö mitattiin teipillä, joka ei venynyt, ja samalla teipillä mitattiin myös lantion ympärysmitta. Lantion ympärysmitta mitattiin vartalon kohdasta, jossa iso trochanteri oli suurin, kun taas vyötärön ympärysmitta mitattiin vartalon kohdasta, jossa alin kylkiluu ja napa olivat kapeimmillaan. Molemmat mittaukset saatiin 0,50 senttimetrin tarkkuudella. Vyötärö-lantiosuhteen (WHR) laskemiseksi otimme ensin vyötärön keskimääräisen ympärysmitan ja jakoimme sen lantion keskimääräisellä ympärysmitalla. Tulokset lajiteltiin sitten seuraaviin luokkiin: i) normaali WHR alle 0,83 ja (ii) korkea ≥ 0,83 WHR. Biosähköisen impedanssianalyysin (BIA) lähestymistapaa hyödynnettiin saadakseen tietoa kehon koostumuksesta, eli kehon rasvaprosentista (BF%) ja lihasmassasta (770 BIA; In body, Soul, Etelä-Korea). Luokat ovat seuraavat: (i) normaali ≤35 %; ja (ii) korkea > 35 % BF %.

Ruokavaliotiedot

Ohjatun haastattelun aikana ammatilliset ravitsemusterapeutit keräsivät ruokavaliotietoja osallistujilta. Saudi-Arabian elintarvike- ja lääkeviranomainen käytti koehenkilöiden ravinnonsaannin arvioimiseksi validoitua versiota Food Frequency Questionnairesta (FFQ). Osallistujilta kysyttiin kunkin ruoka-aineen määrää, jonka he söivät kuluneen vuoden aikana.

Ulosteiden analyysi

Välittömästi keräämisen jälkeen jokainen ulostenäyte laitettiin välittömästi säiliöihin, jotka eivät päässeet vuotamaan ilmaa ja joiden kannet sopivat kunnolla ennen jäätymistä -80 celsiusasteeseen. Sen jälkeen materiaalit kuljetettiin tutkimuslaitokseen, jossa niitä säilytettiin pakastimessa -80 asteen lämpötilassa jatkotutkimuksiin asti. Sen jälkeen käytettiin DNA-sarjaa DNA:n uuttamiseksi 0,25 g:n jäädytetyistä ulosteista (Katalogi: 12830-50). Käytimme Nano-drop-spektrofotometriä arvioidaksemme uutetun DNA:n pitoisuutta sekä sen puhtautta (suhde 260:280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

Määritettiin, että DNA-pitoisuus oli joko suurempi tai yhtä suuri kuin 1,60. Kirjastojen rakentamiseksi kullekin näytteelle annettiin ensin joukko kombinatorisia kaksoisindeksiä ja sitten se kävi läpi yhteensä 12 kierrosta polymeraasiketjureaktiota (PCR). Koko genomin metagenomista sekvensointitekniikkaa käytettiin bakteerien kokonais-DNA:n sekä Firmicutes-, Bacteroidetes-, Actinobacteria-, Proteobacteria-, Verrucomicrobia- ja Fusobacteria-DNA:n tunnistamiseen. Nämä tiedot lähetettiin sitten CosmosID:lle Yhdysvaltoihin suolen mikrobiotan koostumuksen määrittämiseksi päämikrobien fylan tasolla.

Bioinformatiikan menetelmät

Aiemmin kuvattiin, että kokoamattomat sekvensointilukemat arvioivat suoraan CosmosID-bioinformatiikka-alustalla (jonka omistaa ja ylläpitää CosmosID Inc. Marylandissa). Tämä tehtiin useiden valtakuntien mikrobiomin tutkimiseksi, antibioottiresistenssistä ja virulenssista vastaavien geenien profiloimiseksi sekä eri organismien suhteellisen runsauden mittaamiseksi.

Alfa-diversiteetti Runsauspistemäärämatriiseja suvun, suvun, lajin ja kannan tasolla käytettiin alfadiversiteettikaavioiden luomiseen CosmosID-analyysissä. Vegan on R-paketti, joka mahdollistaa Chaon, Simpsonin ja Shannonin alfan laskemisen, kolme monimuotoisuuden mittaa. R-paketin avulla teimme Wilcoxon Rank-Sum -testejä vertaamalla ryhmiä. R-pakettia käytettiin luomaan tontteja, joissa oli p-arvopeitto.

Beta-diversiteetin pääkoordinaattianalyysit (PCoA) laskettiin käyttämällä CosmosID:stä saatuja bakteereiden kanta-, suku-, laji- ja kantatason matriiseja beeta-monimuotoisuuden PCoA:iden luomiseksi. R:n vegaanipaketin funktiota käytettiin määrittämään Bray-Curtis-erot ryhmien välillä, kun taas apinan PCoA-funktiota käytettiin PCoA-taulukoiden rakentamiseen. Vegaanin adonis2-funktiota käytettiin luomaan permutaatiomonimuuttujavarianssianalyysi (PERMANOVA) jokaiselle etäisyysmatriisille, ja vegaanin betadisper-funktiota käytettiin beetadispersion laskemiseen ja vertailuun ANOVA-menetelmällä. Tonttien luomiseen käytettiin R-pakettia.

Tilastollinen analyysi Kvantitatiivisten muuttujien normaalisuus tarkistettiin ennen analyysin suorittamista. Muuttujien normaalisuus tarkistettiin tarkastelemalla niiden histogrammeja, Q-Q-kaavioita ja/tai arvioimalla niiden vinoutta ja kurtoosia. Jatkuville muuttujille ja lopputuloksille käytimme riippumattomien näytteiden t-testiä. Ne muuttujat, jotka eivät noudattaneet normaalijakauman mallia, arvioitiin käyttämällä ei-parametrisia testejä. Kunkin lihalajin mediaanisaannin perusteella luokiteltiin ihmiset korkean ja vähäisen saannin luokkiin, mikä antoi meille mahdollisuuden eristää tiettyjen lihapalojen vaikutukset. Ei-lihavassa ryhmässä valkoisen lihan kulutus luokiteltiin korkeaksi valkoiseksi lihaksi (HWM), n = 32 tai vähäiseksi valkoiseksi lihaksi (LWM), n = 16 sen perusteella, oliko se yli vai alle 34 grammaa valkoista lihaa kohti. 1000 kaloria. Matalapainoiset (n = 16) ja korkeapainoiset (n = 28) tunnistettiin sen perusteella, oliko heidän saantinsa suositeltua 25 grammaa proteiinia 1 000 kaloria kohti vai ei.

Liikalihamattomat ryhmät jaettiin edelleen niihin, joilla oli paljon punaista lihaa (HRM), n = 21, ja niihin, joilla oli alhainen punaisen lihan saanti (LRM), n = 27 punaisen lihan kulutuksen perusteella. Lihavassa populaatiossa runsas punaisen lihan kulutus määriteltiin (HRM, n=14) ja vähäinen punaisen lihan kulutus (LRM, n=30).

Liha (kokonais- ja lajikohtaisesti) ja suolistofloora korreloitiin käyttämällä Pearson-korrelaatiokerrointa. Ennen parametristen testien tekemistä jokainen ei-normaali muuttuja muutettiin. Arvioitu tilastollinen merkitsevyys ilmoitettiin käyttämällä p-arvoa 0,05 ja 95 % luottamusväliä. Lisäksi Benjamini-Hochbergin kriittinen arvo laskettiin kullekin korrelaatiolle virheellisen havainnoinnin taajuudella 0,25. Analyysissä käytettiin International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics -versiota Windowsille (versio 24; IBM Corp., New York, USA).

Tässä tutkimuksessa CosmosID-sovelluksella vertailtiin liikalihavien ja ei-lihavien ihmisten suoliston mikrobiotaa sekä niiden ihmisten, joiden rasvaprosentti ja vyötärön ja lantion välinen suhde kerrostettiin. heidän syömiensä lihatyyppien ja -määrien ja liikalihavuuden välillä. Keskittyessämme yhden näytteen vaihteluun, käytimme Shannon-testiä alfadiversiteetin mittaamiseen, joka kuvaa lajien runsauden jakautumista tietyssä näytteessä lukuna, joka riippuu lajien tasaisuudesta ja rikkaudesta. Bray-Curtisia käytettiin analysoimaan näytteiden välisen samankaltaisuuden tai erilaisuuden astetta beetan monimuotoisuuden suhteen.