장내 미생물 구성에 대한 지방 및 기타 요인의 영향

재료 및 방법

연구 설계

2019년 1월부터 2020년 3월까지 리야드의 King Saud University 캠퍼스에 위치한 College of Applied Medical Sciences 클리닉에서 더 큰 연구가 수행되었습니다. 이 연구는 더 큰 연구의 구성 요소가 될 것입니다. 이 연구의 주요 목적은 위장의 미생물군과 비만 표지자 사이에 존재하는 연관성의 본질을 조사하는 것입니다. 연구 방법론은 다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다. 92명의 표본 크기는 이전 연구와 유사한 방식으로 결정되었으며, 장내 미생물의 구성과 고등 교육을 받은 사우디 여성 간의 차이점을 기반으로 유의 수준은 5%, 검정력은 80%로 설정했습니다. 95% 신뢰구간(CI)과 80% 검정력으로 정상 체중 여성의 경우 0.9:0.4, 비만 여성의 경우 1.7:1.7의 Firmicutes: Bacteroidetes를 예상합니다. 또한 사람들은 전단지, 교직원 지원, 프레젠테이션 및 소셜 미디어를 사용하여 무작위로 입대했습니다. 다음 제외 기준을 가진 참가자는 분석에 포함되지 않았습니다: 18세, 과체중, 체질량 지수(BMI) 25-29.9 kg/m2), 임신 중, 특정 식이요법(예: 칼로리 제한 식이요법)을 따름, 지난 8주 동안 위장관 질환의 존재를 보고함, 내분비 또는 종양 질환의 병력, 정신 장애, 식욕 부진, 기타 의학적 상태 , 또는 종합 비타민, 비타민 B를 사용합니다.

각 참가자에게는 대변 샘플을 해당 시간까지 보관할 용기와 함께 연구가 수행된 동일한 대학의 영양 클리닉에 반환할 시간과 날짜가 주어졌습니다. 참가자는 공복 혈액 샘플을 제공하고 인구 통계, 영양 및 인체 측정 정보를 기록했습니다. 18세에서 25세 사이의 92명의 사우디 여학생을 최종 샘플로 구성하여 비만(BMI 30kg/m2) 그룹(n=44)과 비만 그룹(BMI=18.50-BMI=18.50- 24.99 kg/m2) (n=48). King Saud University의 King Khalid University Hospital Institutional Review Board Committee는 연구 프로토콜(IRB #E-19-3625)을 승인했습니다.

인체 측정

자격을 갖춘 직원이 확립된 프로토콜을 사용하여 피험자의 인체측정법을 측정했습니다. 동일한 측정을 두 번 수행했으며 두 번째 기록의 결과를 최종 연구를 위해 평균화했습니다. 피험자의 키와 몸무게는 국제 표준 척도로 측정되었으며 각각 0.10kg과 0.50cm에 가장 근접한 단위로 문서화되었습니다. 피험자의 체중을 결정하고 0.10kg 단위로 기록했습니다(Digital Pearson Scale, Oxford, USA). 개인의 BMI를 계산하기 위해 체중(kg)을 키(m)의 제곱으로 나누었습니다. 결과는 BMI였습니다. 세계보건기구(WHO)는 체질량지수(BMI)가 1제곱미터당 18.50~24.99kg인 사람을 평균 체중으로, 제곱미터당 BMI가 30kg 이상인 사람을 비만으로 정의했다.

대상자의 허리는 늘어나지 않는 테이프로 측정하였고 엉덩이 둘레도 동일한 테이프로 측정하였다. 엉덩이둘레는 몸에서 대전자가 가장 큰 곳을 측정하였고, 허리둘레는 몸에서 가장 아래 갈비뼈와 배꼽이 가장 좁은 곳을 측정하였다. 두 측정 모두 0.50cm 이내의 정확도로 얻어졌습니다. 허리-엉덩이 비율(WHR)을 계산하기 위해 먼저 허리의 평균 둘레를 엉덩이의 평균 둘레로 나누었습니다. 그런 다음 결과를 다음 범주로 분류했습니다. i) 0.83 미만의 정상 WHR 및 (ii) 높음 ≥0.83 WHR. BIA(Bioelectrical Impedance Analysis) 접근법은 체성분, 즉 체지방률(BF%)과 근육량(770 BIA; In body, Seoul, South Korea)에 관한 정보를 얻기 위해 활용되었습니다. 범주는 다음과 같습니다: (i) 정상 ≤35%; 및 (ii) 높음 >35% BF%.

식이 데이터

가이드 인터뷰 과정에서 전문 영양사는 참가자들로부터 식단 정보를 수집했습니다. 피험자의 음식 섭취량을 평가하기 위해 사우디 식품의약청(Saudi Food and Drug Authority)에서 검증된 FFQ(Food Frequency Questionnaire) 버전을 사용했습니다. 참가자들은 전년도 동안 소비한 각 식품의 양에 대해 질문을 받았습니다.

대변 ​​분석

수집 직후 각 대변 샘플은 즉시 공기가 새지 않고 뚜껑이 단단히 고정된 용기에 넣어 섭씨 -80도에서 동결했습니다. 그 후 재료는 연구 시설로 이송되어 추가 검사가 있을 때까지 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관되었습니다. 그 후, DNA Kit를 이용하여 냉동 분변 0.25g(Catalogue: 12830-50) 분취량에서 DNA를 추출하였다. 우리는 Nano-drop 분광광도계를 사용하여 추출된 DNA의 농도와 순도(260 대 280의 비율)를 평가했습니다(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

DNA 농도가 1.60 이상인 것으로 결정되었습니다. 라이브러리를 구성하기 위해 각 샘플은 먼저 일련의 조합 이중 인덱스를 할당받은 후 총 12회의 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 거쳤습니다. 전체 게놈 metagenomic sequencing 기술은 Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia 및 Fusobacteria의 DNA뿐만 아니라 총 박테리아 DNA를 확인하는 데 사용되었습니다. 이 정보는 주요 미생물 문(phyla) 수준에서 장내 미생물의 구성을 결정하기 위해 미국의 CosmosID로 전송되었습니다.

생물 정보학 방법

조립되지 않은 시퀀싱 판독값은 CosmosID 생물 정보학 플랫폼(메릴랜드의 CosmosID Inc.에서 소유하고 운영함)에서 직접 평가했다고 이전에 설명했습니다. 이것은 여러 왕국의 미생물 군집에 대한 조사를 수행하고, 항생제 내성과 병독성을 담당하는 유전자를 프로파일링하고, 다양한 유기체의 상대적 풍부도를 측정하기 위해 수행되었습니다.

알파 다양성 CosmosID 분석에서 알파 다양성 플롯을 생성하기 위해 문, 속, 종 및 변형 수준의 존재도 점수 매트릭스를 사용했습니다. Vegan은 다양성의 세 가지 척도인 Chao, Simpson 및 Shannon 알파의 계산을 허용하는 R 패키지입니다. R 패키지를 사용하여 그룹을 비교하는 Wilcoxon Rank-Sum 테스트를 수행했습니다. R 패키지를 활용하여 p-값 오버레이로 플롯을 생성했습니다.

PCoA(Beta Diversity Principal Coordinate Analyzes)는 베타 다양성 PCoA를 생성하기 위해 CosmosID에서 얻은 박테리아에 대한 문(phylum), 속(genus), 종(species) 및 균주 수준 매트릭스를 사용하여 계산되었습니다. R의 완전 채식 패키지 기능은 그룹 간의 Bray-Curtis 비 유사성을 결정하는 데 사용되었으며 ape의 PCoA 기능은 PCoA 테이블을 구성하는 데 사용되었습니다. Vegan의 adonis2 함수를 사용하여 각 거리 행렬에 대한 PERMANOVA(Permutational multivariate analysis of variance) 테스트를 생성하고 vegan의 betadisper 함수를 사용하여 ANOVA 방법을 사용하여 베타 분산을 계산하고 비교했습니다. R 패키지는 플롯을 생성하는 데 사용되었습니다.

통계분석 정량변수의 정규성을 분석하기 전에 확인하였다. 변수의 정규성은 히스토그램, Q-Q 플롯을 검사하고/하거나 왜도 및 첨도를 평가하여 확인했습니다. 연속 변수 및 최종 결과를 위해 독립 샘플 t-테스트를 ​​사용했습니다. 정규 분포 패턴을 따르지 않는 변수는 비모수 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 각 육류 유형의 중간 섭취량은 사람들을 높은 섭취량 범주와 낮은 섭취량 범주로 분류하는 데 사용되어 특정 육류 부위의 효과를 분리할 수 있습니다. 비만이 아닌 그룹에서 흰색 고기 소비는 1인당 34g 이상 또는 미만인지 여부에 따라 높은 흰색 고기(HWM), n=32 또는 낮은 흰색 고기(LWM), n=16으로 분류되었습니다. 1,000칼로리. 저체중 개인(n=16)과 고체중 개인(n=28)은 섭취량이 1,000칼로리당 단백질 권장량인 25g 이상인지 여부에 따라 식별되었습니다.

비만이 아닌 그룹은 붉은 고기 섭취량을 기준으로 붉은 고기 섭취량이 높은(HRM) n=21 섭취군과 낮은 붉은 고기 섭취량(LRM) n=27인 그룹으로 더 나누었습니다. 비만 인구에서 높은 붉은 육류 소비는 (HRM, n=14)로 정의되었고 낮은 붉은 육류 소비는 (LRM, n=30)으로 정의되었습니다.

육류(전체 및 종류별)와 장내 세균총은 Pearson 상관 계수를 사용하여 상관관계를 나타냈습니다. 파라메트릭 테스트를 수행하기 전에 모든 비정규 변수가 변환되었습니다. 추정된 통계적 유의성은 p-값 0.05와 95% CI를 사용하여 보고되었습니다. 또한 잘못된 발견율 0.25에서 각 상관관계에 대해 Benjamini-Hochberg 임계값을 계산했습니다. Windows용 IBM(International Business Machines) 통계 패키지 for the Social Sciences(SPSS) 통계 버전이 분석에 사용되었습니다(버전 24, IBM Corp., New York, USA).

본 연구는 CosmosID 애플리케이션을 사용하여 비만인 사람과 비만하지 않은 사람, 그리고 체지방률과 허리-엉덩이 비율로 계층화된 사람들의 장내 미생물을 비교하여 상관 관계가 있는지 확인했습니다. 그들이 먹은 고기의 종류와 양과 비만 사이. 단일 샘플 내의 변이에 집중하여 Shannon 테스트를 사용하여 알파 다양성을 측정했습니다. 이 테스트는 특정 샘플의 종 풍부도 분포를 종 균일성과 풍부도에 따라 달라지는 숫자로 나타냅니다. Bray-Curtis는 베타 다양성에 대한 샘플 간의 유사성 또는 비유사성 정도를 분석하는 데 사용되었습니다.