Influenza dell'adiposità e di altri fattori sulla composizione del microbiota intestinale

Materiali e metodi

Progettazione dello studio

Da gennaio 2019 a marzo 2020, è stato condotto uno studio più ampio presso la clinica del College of Applied Medical Sciences situata nel campus della King Saud University di Riyadh. Questa ricerca sarà una componente di quello studio più ampio. Lo scopo principale di questa ricerca è indagare la natura della connessione che esiste tra il microbiota nello stomaco e i marcatori dell'obesità. La metodologia dello studio è descritta in dettaglio altrove. La dimensione del campione di 92 è stata determinata in modo simile a uno studio precedente, con il livello di significatività fissato al 5% e il potere fissato all'80%, in base alla composizione del microbiota intestinale e alle sue differenze tra le donne saudite nell'istruzione superiore. Con un intervallo di confidenza (CI) del 95% e una potenza dell'80%, ci aspettiamo un Firmicutes: Bacteroidetes di 0,9:0,4 nelle donne di peso normale e di 1,7:1,7 nelle donne con obesità. Inoltre, le persone sono state arruolate a caso utilizzando volantini, aiuti di facoltà, presentazioni e social media. I partecipanti con i seguenti criteri di esclusione non sono stati inclusi nell'analisi: età 18 anni, sovrappeso, indice di massa corporea (BMI) 25-29,9 kg/m2), essere in stato di gravidanza, seguire una dieta specifica (ad esempio una dieta ipocalorica), segnalare la presenza di malattie gastrointestinali nelle ultime otto settimane, una storia di malattie endocrine o oncologiche, disturbi psichiatrici, anoressia, altre condizioni mediche , o utilizzando multivitaminici, vitamina B.

Ad ogni partecipante è stata data un'ora e una data per restituire un campione di feci alla clinica nutrizionale dello stesso College in cui è stato condotto lo studio, insieme a un contenitore in cui conservarlo fino a quel momento. I partecipanti hanno fornito campioni di sangue a digiuno e hanno registrato le loro informazioni demografiche, nutrizionali e antropometriche. Il campione finale è stato costituito da novantadue studentesse saudite di età compresa tra i 18 e i 25 anni, divise in due gruppi: quelle con obesità (BMI 30 kg/m2) (n=44) e quelle senza (BMI=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). Il comitato del consiglio di revisione istituzionale del King Khalid University Hospital della King Saud University ha dato il suo nulla osta al protocollo dello studio (IRB #E-19-3625).

Misure antropometriche

Le misurazioni dell'antropometria del soggetto sono state effettuate da personale qualificato utilizzando protocolli stabiliti. Le stesse misurazioni sono state effettuate due volte e i risultati della seconda registrazione sono stati mediati per lo studio finale. L'altezza e il peso del soggetto sono stati misurati su una scala standard internazionale e documentati rispettivamente con l'approssimazione di 0,10 kg e 0,50 cm. Il peso del soggetto è stato determinato e documentato con l'approssimazione di 0,10 kg (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). Per calcolare il BMI di un individuo, abbiamo preso il suo peso in chilogrammi e lo abbiamo diviso per il quadrato della sua altezza in metri. Il risultato è stato il BMI. L'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha specificato che il peso medio ha un indice di massa corporea (BMI) compreso tra 18,50 e 24,99 chilogrammi per metro quadrato, mentre il peso obeso è stato definito come avente un BMI superiore a 30 chilogrammi per metro quadrato.

La vita dell'individuo è stata misurata con un nastro che non si allungava e anche la circonferenza dei fianchi è stata misurata con lo stesso nastro. La misura della circonferenza dell'anca è stata presa nel punto del corpo in cui il grande trocantere era al suo massimo, mentre la misura della circonferenza della vita è stata presa nel punto del corpo in cui la costola più bassa e l'ombelico erano più stretti. Entrambe le misurazioni sono state ottenute con una precisione di 0,50 centimetri. Per calcolare il rapporto vita-fianchi (WHR), abbiamo prima preso la circonferenza media della vita e l'abbiamo divisa per la circonferenza media dei fianchi. I risultati sono stati quindi ordinati nelle seguenti categorie: i) WHR normale inferiore a 0,83 e (ii) alto ≥0,83 WHR. L'approccio dell'analisi dell'impedenza bioelettrica (BIA) è stato utilizzato per acquisire informazioni sulla propria composizione corporea, in particolare la percentuale di grasso corporeo (BF%) e la massa muscolare (770 BIA; In body, Seoul, Corea del Sud). Le categorie sono le seguenti: (i) normale ≤35%; e (ii) Alto >35% BF%.

Dati dietetici

Nel corso di un'intervista guidata, dietologi professionisti hanno raccolto informazioni dietetiche dai partecipanti. Per valutare l'assunzione di cibo dei soggetti, è stata utilizzata una versione convalidata del Food Frequency Questionnaire (FFQ) dalla Saudi Food and Drug Authority. I partecipanti sono stati interrogati sulla quantità di ciascun alimento che hanno consumato nel corso dell'anno precedente.

Analisi delle feci

Immediatamente dopo la raccolta, ogni campione di feci è stato immediatamente posto in contenitori che non potevano perdere aria e avevano coperchi che si adattavano saldamente prima di essere congelati a -80 gradi Celsius. Successivamente, i materiali sono stati trasportati alla struttura di ricerca, dove sono stati conservati in un congelatore a una temperatura di -80 gradi Celsius fino a ulteriore esame. Successivamente, è stato utilizzato il DNA Kit per estrarre il DNA da aliquote di 0,25 g di feci congelate (Catalogo: 12830-50). Abbiamo utilizzato uno spettrofotometro Nano-drop per valutare la concentrazione del DNA estratto e la sua purezza (il rapporto da 260 a 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

È stato determinato che la concentrazione di DNA era maggiore o uguale a 1,60. Per costruire librerie, a ciascun campione è stato prima assegnato un set di doppi indici combinatori, quindi è stato sottoposto a un totale di 12 cicli di reazione a catena della polimerasi (PCR). La tecnica di sequenziamento metagenomico dell'intero genoma è stata utilizzata per identificare il DNA batterico totale e il DNA di Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia e Fusobacteria. Queste informazioni sono state poi inviate a CosmosID negli Stati Uniti, al fine di determinare la composizione del microbiota intestinale a livello dei principali phyla microbici.

Metodi di bioinformatica

È stato descritto in precedenza che le letture di sequenziamento non assemblate sono state valutate direttamente dalla piattaforma bioinformatica CosmosID (che è di proprietà e gestita da CosmosID Inc. nel Maryland). Ciò è stato effettuato per effettuare un esame del microbioma di più regni, profilare i geni responsabili della resistenza e della virulenza agli antibiotici e misurare l'abbondanza relativa di vari organismi.

Diversità alfa Le matrici del punteggio di abbondanza a livello di phylum, genere, specie e ceppo sono state utilizzate per creare grafici di diversità alfa nell'analisi CosmosID. Vegan è un pacchetto R che consente il calcolo di Chao, Simpson e Shannon alfa, tre misure di diversità. Utilizzando il pacchetto R, abbiamo condotto i test Wilcoxon Rank-Sum confrontando i gruppi. Il pacchetto R è stato utilizzato per creare grafici con sovrapposizione del valore p.

Le analisi delle coordinate principali della diversità beta (PCoA) sono state calcolate utilizzando matrici a livello di phylum, genere, specie e ceppo per i batteri ottenuti da CosmosID per generare PCoA di diversità beta. La funzione del pacchetto vegano di R è stata utilizzata per determinare la dissomiglianza di Bray-Curtis tra i gruppi, mentre la funzione PCoA di ape è stata utilizzata per costruire tabelle PCoA. La funzione adonis2 di Vegan è stata utilizzata per generare i test di analisi della varianza multivariata permutazionale (PERMANOVA) per ciascuna matrice di distanza e la funzione betadisper di Vegan è stata utilizzata per calcolare e confrontare la dispersione beta utilizzando il metodo ANOVA. Il pacchetto R è stato utilizzato per generare i grafici.

Analisi statistica La normalità delle variabili quantitative è stata verificata prima dell'esecuzione dell'analisi. La normalità delle variabili è stata verificata ispezionando i loro istogrammi, grafici Q-Q e/o valutando la loro asimmetria e curtosi. Per variabili continue e risultati finali, abbiamo utilizzato il test t per campioni indipendenti. Quelle variabili che non seguivano un normale modello di distribuzione sono state valutate utilizzando test non parametrici. L'assunzione mediana di ogni tipo di carne è stata utilizzata per classificare le persone in categorie ad alto e basso consumo, permettendoci di isolare gli effetti di specifici tagli di carne. Nel gruppo dei non obesi, il consumo di carne bianca è stato classificato come ad alto contenuto di carne bianca (HWM), n=32 o a basso consumo di carne bianca (LWM), n=16 in base al fatto che fosse superiore o inferiore a 34 grammi di carne bianca per 1.000 calorie. Gli individui di basso peso (n=16) e quelli di peso elevato (n=28) sono stati identificati in base al fatto che la loro assunzione fosse pari o superiore al livello raccomandato di 25 grammi di proteine ​​per 1.000 calorie.

Il gruppo dei non obesi è stato ulteriormente suddiviso in quelli con un elevato consumo di carne rossa (HRM), n=21 e quelli con un basso consumo di carne rossa (LRM), n=27 in base al loro consumo di carne rossa. Nella popolazione obesa, l'elevato consumo di carne rossa è stato definito come (HRM, n=14) e il basso consumo di carne rossa è stato definito come (LRM, n=30).

La carne (totale e per tipo) e la flora intestinale sono state correlate utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson. Prima di eseguire qualsiasi test parametrico, ogni variabile non normale è stata trasformata. La significatività statistica stimata è stata riportata utilizzando un valore p di 0,05 e un CI del 95%. Inoltre, il valore critico di Benjamini-Hochberg è stato calcolato per ogni correlazione con un tasso di false scoperte di 0,25. Per l'analisi è stato utilizzato l'International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics versione per Windows (versione 24; IBM Corp., New York, USA).

Questo studio ha utilizzato l'applicazione CosmosID per confrontare il microbiota intestinale di persone obese e non obese, nonché di coloro che sono stati stratificati in base alla percentuale di grasso corporeo e al rapporto vita-fianchi, per determinare se esisteva una correlazione tra i tipi e le quantità di carne che mangiavano e la loro obesità. Concentrandoci sulla variazione all'interno di un singolo campione, abbiamo utilizzato il test di Shannon per misurare la diversità alfa, che descrive la distribuzione delle abbondanze di specie in un particolare campione come un numero che dipende dall'uniformità e dalla ricchezza delle specie. Bray-Curtis è stato utilizzato per analizzare il grado di somiglianza o dissomiglianza tra i campioni per la diversità beta.