Invloed van vetzucht en andere factoren op de samenstelling van de darmmicrobiota

Materialen en methodes

Ontwerp ontwerpen

Van januari 2019 tot maart 2020 werd een grotere studie uitgevoerd in de kliniek van het College of Applied Medical Sciences op de campus van de King Saud University in Riyad. Dit onderzoek zal een onderdeel zijn van dat grotere onderzoek. Het primaire doel van dit onderzoek is het onderzoeken van de aard van het verband dat bestaat tussen de microbiota in de maag en markers van obesitas. De methodologie van de studie wordt elders in detail beschreven. De steekproefomvang van 92 werd bepaald op een manier vergelijkbaar met een eerdere studie, met het significantieniveau vastgesteld op 5% en het vermogen vastgesteld op 80%, gebaseerd op de samenstelling van de darmmicrobiota en de verschillen tussen Saoedische vrouwen in het hoger onderwijs. Met een betrouwbaarheidsinterval (BI) van 95% en een vermogen van 80% verwachten we een Firmicutes: Bacteroidetes van 0,9:0,4 bij vrouwen met een normaal gewicht en 1,7:1,7 bij vrouwen met obesitas. Ook werden mensen willekeurig ingelijfd met behulp van folders, facultaire hulp, presentaties en sociale media. Deelnemers met de volgende uitsluitingscriteria werden niet meegenomen in de analyse: leeftijd 18 jaar, overgewicht, body mass index (BMI) 25-29,9 kg/m2), zwanger zijn, een specifiek dieet volgen (bijv. een caloriebeperkt dieet), melding maken van gastro-intestinale aandoeningen in de afgelopen acht weken, een voorgeschiedenis van endocriene of oncologische aandoeningen, psychiatrische stoornissen, anorexia, andere medische aandoeningen , of het gebruik van multivitaminen, vitamine B.

Elke deelnemer kreeg een tijd en datum om een ​​ontlastingsmonster terug te brengen naar de voedingskliniek in hetzelfde College waar het onderzoek werd uitgevoerd, samen met een container waarin het tot die tijd kon worden bewaard. Deelnemers verstrekten nuchtere bloedmonsters en lieten hun demografische, voedings- en antropometrische informatie vastleggen. Tweeënnegentig Saoedische vrouwelijke studenten tussen de 18 en 25 jaar oud vormden de uiteindelijke steekproef, en ze werden verdeeld in twee groepen: zij met obesitas (BMI 30 kg/m2) (n=44) en zij zonder (BMI=18,50- 24,99 kg/m²) (n=48). Het King Khalid University Hospital Institutional Review Board Committee van de King Saud University gaf toestemming voor het onderzoeksprotocol (IRB #E-19-3625).

Antropometrische metingen

Metingen van de antropometrie van het onderwerp werden uitgevoerd door gekwalificeerd personeel met behulp van vastgestelde protocollen. Dezelfde metingen werden twee keer uitgevoerd en de resultaten van de tweede opname werden gemiddeld voor het laatste onderzoek. De lengte en het gewicht van de proefpersoon werden gemeten op een internationale standaardschaal en gedocumenteerd tot op respectievelijk 0,10 kg en 0,50 cm nauwkeurig. Het gewicht van de proefpersoon werd bepaald en gedocumenteerd tot op 0,10 kg nauwkeurig (Digital Pearson Scale; Oxford, VS). Om de BMI van een persoon te berekenen, namen we hun gewicht in kilogram en deelden dit door het kwadraat van hun lengte in meters. Het resultaat was de BMI. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) specificeerde het gemiddelde gewicht als een body mass index (BMI) tussen 18,50 en 24,99 kilogram per vierkante meter, terwijl obesitas werd gedefinieerd als een BMI van meer dan 30 kilogram per vierkante meter.

De taille van het individu werd gemeten met een meetlint dat niet uitrekt, en hun heupomtrek werd ook gemeten met hetzelfde meetlint. De heupomtrek werd gemeten op het punt op het lichaam waar de grote trochanter het grootst was, terwijl de tailleomtrek werd gemeten op het punt op het lichaam waar de onderste rib en de navel het smalst waren. Beide metingen werden verkregen met een nauwkeurigheid van minder dan 0,50 centimeter. Om de taille-heupratio (WHR) te berekenen, hebben we eerst de gemiddelde omtrek van de taille genomen en gedeeld door de gemiddelde omtrek van de heupen. De resultaten werden vervolgens gesorteerd in de volgende categorieën: i) een normale WHR van minder dan 0,83 en (ii) hoog ≥0,83 WHR. De bio-elektrische impedantieanalyse (BIA)-benadering werd gebruikt om informatie te verkrijgen over iemands lichaamssamenstelling, namelijk hun lichaamsvetpercentage (BF%) en hun spiermassa (770 BIA; In body, Seoul, Zuid-Korea). De categorieën zijn als volgt: (i) normaal ≤35%; en (ii) Hoog >35% BF%.

Dieet gegevens

Tijdens een begeleid interview verzamelden professionele diëtisten voedingsinformatie van deelnemers. Om de voedselinname van de proefpersonen te evalueren, werd een gevalideerde versie van de Food Frequency Questionnaire (FFQ) gebruikt door de Saudi Food and Drug Authority. De deelnemers werden ondervraagd over de hoeveelheid van elk voedingsmiddel die ze in de loop van het voorgaande jaar hadden geconsumeerd.

Ontlasting analyse

Onmiddellijk na het verzamelen werd elk ontlastingsmonster onmiddellijk in containers geplaatst die geen lucht konden lekken en deksels hadden die goed sloten voordat ze werden ingevroren bij -80 graden Celsius. Daarna zijn de materialen naar de onderzoeksfaciliteit getransporteerd, waar ze tot nader onderzoek in een vriezer werden bewaard bij een temperatuur van -80 graden Celsius. Daarna werd de DNA-kit gebruikt om DNA te extraheren uit aliquots van 0,25 g bevroren feces (Catalogus: 12830-50). We gebruikten een Nano-drop-spectrofotometer om de concentratie van het geëxtraheerde DNA en de zuiverheid ervan (de verhouding van 260 tot 280) te beoordelen (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VS).

Er werd vastgesteld dat de DNA-concentratie groter was dan of gelijk was aan 1,60. Om bibliotheken te construeren, kreeg elk monster eerst een reeks combinatorische dubbele indexen toegewezen en vervolgens doorliep het in totaal 12 ronden van Polymerase Chain Reaction (PCR). De metagenomische sequencingtechniek van het hele genoom werd gebruikt om het totale bacteriële DNA te identificeren, evenals het DNA van Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia en Fusobacteria. Deze informatie werd vervolgens naar CosmosID in de Verenigde Staten gestuurd om de samenstelling van de darmmicrobiota op het niveau van de belangrijkste microbiële phyla te bepalen.

Bio-informatica-methoden

Eerder werd beschreven dat de niet-geassembleerde sequencing-lezingen rechtstreeks werden geëvalueerd door het CosmosID bioinformatica-platform (dat eigendom is van en wordt beheerd door CosmosID Inc. in Maryland). Dit werd uitgevoerd om het microbioom van meerdere koninkrijken te onderzoeken, de genen te profileren die verantwoordelijk zijn voor antibioticaresistentie en virulentie, en de relatieve overvloed van verschillende organismen te meten.

Alfa-diversiteit De matrices van de abundantiescore op het niveau van phylum, genus, soort en stam werden gebruikt om alfa-diversiteitsgrafieken te maken in de CosmosID-analyse. Vegan is een R-pakket dat de berekening van Chao, Simpson en Shannon alpha mogelijk maakt, drie maatstaven voor diversiteit. Met behulp van het R-pakket hebben we Wilcoxon Rank-Sum-tests uitgevoerd waarbij de groepen werden vergeleken. Het R-pakket werd gebruikt om plots met p-waarde-overlay te maken.

Beta Diversity Principal Coordinate Analyses (PCoA) werden berekend met behulp van phylum-, genus-, species- en stamniveaumatrices voor bacteriën verkregen van CosmosID om beta-diversiteit PCoA's te genereren. De functie van het veganistische pakket van R werd gebruikt om de Bray-Curtis-ongelijkheid tussen groepen te bepalen, terwijl de PCoA-functie van aap werd gebruikt om PCoA-tabellen te construeren. Vegan's adonis2-functie werd gebruikt om Permutational multivariate variantieanalyse (PERMANOVA) -tests voor elke afstandsmatrix te genereren, en vegan's betadisper-functie werd gebruikt om beta-dispersie te berekenen en te vergelijken met behulp van de ANOVA-methode. Het R-pakket werd gebruikt om de percelen te genereren.

Statistische analyse De normaliteit van de kwantitatieve variabelen werd gecontroleerd voordat de analyse werd uitgevoerd. De normaliteit van de variabelen werd gecontroleerd door hun histogrammen, Q-Q-plots te inspecteren en/of hun scheefheid en kurtosis te beoordelen. Voor continue variabelen en eindresultaten hebben we de t-toets voor onafhankelijke steekproeven gebruikt. Die variabelen die geen normaal verdelingspatroon volgden, werden geëvalueerd met behulp van niet-parametrische tests. De mediane inname van elk type vlees werd gebruikt om mensen in te delen in hoge en lage innamecategorieën, waardoor we de effecten van specifieke stukken vlees konden isoleren. In de niet-zwaarlijvige groep werd de consumptie van wit vlees gecategoriseerd als hoog wit vlees (HWM), n=32 of laag wit vlees (LWM), n=16 op basis van het feit of het meer of minder dan 34 gram wit vlees per 1.000 calorieën. Personen met een laag gewicht (n=16) en personen met een hoog gewicht (n=28) werden geïdentificeerd op basis van het feit of hun inname op of boven het aanbevolen niveau van 25 gram eiwit per 1000 calorieën lag.

De niet-zwaarlijvige groep werd verder verdeeld in mensen met een hoge inname van rood vlees (HRM), n=21 en mensen met een lage inname van rood vlees (LRM), n=27 op basis van hun consumptie van rood vlees. In de zwaarlijvige populatie werd een hoge consumptie van rood vlees gedefinieerd als (HRM, n=14) en een lage consumptie van rood vlees werd gedefinieerd als (LRM, n=30).

Vlees (totaal en per soort) en darmflora werden gecorreleerd met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt. Voordat er parametrische tests werden uitgevoerd, werd elke niet-normale variabele getransformeerd. Geschatte statistische significantie werd gerapporteerd met een p-waarde van 0,05 en een 95% BI. Verder werd de kritische waarde van Benjamini-Hochberg berekend voor elke correlatie met een valse ontdekkingssnelheid van 0,25. De International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics-versie voor Windows werd gebruikt voor de analyse (versie 24; IBM Corp., New York, VS).

Deze studie gebruikte de CosmosID-applicatie om de darmmicrobiota te vergelijken van mensen die zwaarlijvig waren en mensen die niet zwaarlijvig waren, evenals degenen die gestratificeerd waren op basis van hun lichaamsvetpercentage en taille-tot-heupverhouding, om te bepalen of er een correlatie was tussen de soorten en hoeveelheden vlees die ze aten en hun zwaarlijvigheid. Door ons te concentreren op variatie binnen een enkel monster, hebben we de Shannon-test gebruikt om de alfa-diversiteit te meten, die de verdeling van de soortenrijkdom in een bepaald monster weergeeft als een getal dat afhangt van de gelijkmatigheid en rijkdom van soorten. Bray-Curtis werd gebruikt om de mate van overeenkomst of ongelijkheid tussen monsters voor bèta-diversiteit te analyseren.