Влияние ожирения и других факторов на состав микробиоты кишечника

Материалы и методы

Дизайн исследования

С января 2019 года по март 2020 года в клинике Колледжа прикладных медицинских наук, расположенной на территории кампуса Университета короля Сауда в Эр-Рияде, было проведено более масштабное исследование. Это исследование станет частью более крупного исследования. Основной целью этого исследования является изучение характера связи, которая существует между микробиотой в желудке и маркерами ожирения. Методология исследования подробно описана в другом месте. Размер выборки из 92 человек был определен аналогично предыдущему исследованию, с уровнем значимости, установленным на уровне 5%, и мощностью, установленной на уровне 80%, на основе состава микробиоты кишечника и ее различий среди саудовских женщин с высшим образованием. При 95% доверительном интервале (ДИ) и мощности 80% мы ожидаем, что Firmicutes: Bacteroidetes составит 0,9:0,4 у женщин с нормальным весом и 1,7:1,7 у женщин с ожирением. Кроме того, люди были зачислены случайным образом с использованием листовок, методических пособий, презентаций и социальных сетей. В анализ не включались участники со следующими исключающими критериями: возраст 18 лет, избыточная масса тела, индекс массы тела (ИМТ) 25-29,9. кг/м2), беременность, соблюдение определенной диеты (например, диеты с ограничением калорий), наличие желудочно-кишечных заболеваний в течение последних восьми недель, эндокринные или онкологические заболевания в анамнезе, психические расстройства, анорексия, другие заболевания , или используя поливитамины, витамин B.

Каждому участнику было дано время и дата, чтобы вернуть образец стула в клинику питания в том же колледже, где проводилось исследование, вместе с контейнером, в котором он должен храниться до этого времени. Участники предоставили образцы крови натощак и записали свою демографическую, пищевую и антропометрическую информацию. Окончательную выборку составили 92 студентки из Саудовской Аравии в возрасте от 18 до 25 лет, которые были разделены на две группы: с ожирением (ИМТ 30 кг/м2) (n=44) и без (ИМТ=18,50- 24,99 кг/м2) (n=48). Комитет институционального наблюдательного совета больницы Университета короля Халида Университета короля Сауда одобрил протокол исследования (IRB #E-19-3625).

Антропометрические измерения

Антропометрические измерения субъекта проводились квалифицированным персоналом с использованием установленных протоколов. Одни и те же измерения проводились дважды, и результаты второй записи усреднялись для окончательного исследования. Рост и вес субъекта измерялись по международной стандартной шкале и документировались с точностью до 0,10 кг и 0,50 см соответственно. Вес испытуемого определяли и документировали с точностью до 0,10 кг (цифровая шкала Пирсона; Оксфорд, США). Чтобы рассчитать ИМТ человека, мы взяли его вес в килограммах и разделили на квадрат роста в метрах. Результатом был ИМТ. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила средний вес как имеющий индекс массы тела (ИМТ) от 18,50 до 24,99 кг на квадратный метр, в то время как вес с ожирением был определен как имеющий ИМТ более 30 кг на квадратный метр.

Талия человека была измерена с помощью ленты, которая не растягивалась, и их окружность бедер также была измерена той же лентой. Измерение окружности бедер проводилось в той точке тела, где большой вертел находился в самом большом месте, тогда как измерение окружности талии проводилось в той точке тела, где самое нижнее ребро и пупок были наиболее узкими. Оба измерения были получены с точностью до 0,50 сантиметра. Чтобы рассчитать соотношение талии и бедер (WHR), мы сначала взяли среднюю окружность талии и разделили ее на среднюю окружность бедер. Затем результаты были отсортированы по следующим категориям: i) нормальный WHR менее 0,83 и (ii) высокий ≥0,83. WHR. Подход анализа биоэлектрического импеданса (BIA) использовался для получения информации о составе тела, а именно о процентном содержании жира в организме (BF%) и мышечной массе (770 BIA; In body, Сеул, Южная Корея). Категории следующие: (i) нормальный ≤35%; и (ii) Высокий >35% BF%.

Диетические данные

В ходе управляемого интервью профессиональные диетологи собрали информацию о питании участников. Чтобы оценить потребление пищи испытуемыми, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Саудовской Аравии использовало утвержденную версию Опросника частоты приема пищи (FFQ). Участникам был задан вопрос о количестве каждого продукта питания, который они потребляли в течение предыдущего года.

Анализ стула

Сразу после сбора каждый образец стула немедленно помещали в контейнеры, которые не пропускали воздух и имели крышки, которые надежно закрывались, прежде чем замораживались при температуре -80 градусов по Цельсию. После этого материалы были доставлены в исследовательский центр, где хранились в морозильной камере при температуре -80 градусов по Цельсию до дальнейшего исследования. После этого ДНК-набор использовали для выделения ДНК из аликвоты по 0,25 г замороженных фекалий (каталог: 12830-50). Мы использовали спектрофотометр Nano-drop для оценки концентрации выделенной ДНК, а также ее чистоты (соотношение 260 к 280) (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США).

Было определено, что концентрация ДНК была больше или равна 1,60. Для создания библиотек каждому образцу сначала был присвоен набор комбинаторных двойных индексов, а затем он прошел в общей сложности 12 раундов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полногеномного метагеномного секвенирования был использован для идентификации общей бактериальной ДНК, а также ДНК Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia и Fusobacteria. Затем эта информация была отправлена ​​в CosmosID в США, чтобы определить состав микробиоты кишечника на уровне основных микробных типов.

Методы биоинформатики

Ранее было описано, что несобранные чтения секвенирования были непосредственно оценены биоинформационной платформой CosmosID (которая принадлежит и управляется CosmosID Inc. в Мэриленде). Это было сделано для того, чтобы провести исследование микробиома нескольких царств, профилировать гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам и вирулентность, и измерить относительную численность различных организмов.

Альфа-разнообразие Матрицы оценки численности на уровне типа, рода, вида и штамма использовались для создания графиков альфа-разнообразия в анализе CosmosID. Vegan — это пакет R, который позволяет вычислять Chao, Simpson и Shannon alpha, три меры разнообразия. Используя пакет R, мы провели тесты суммы рангов Уилкоксона, сравнивая группы. Пакет R использовался для создания графиков с наложением p-значения.

Анализ основных координат бета-разнообразия (PCoA) был рассчитан с использованием матриц типов, родов, видов и штаммов для бактерий, полученных из CosmosID, для создания PCoA бета-разнообразия. Функция веганского пакета R использовалась для определения несходства Брея-Кертиса между группами, а функция PCoA в ape использовалась для построения таблиц PCoA. Функция adonis2 Вегана использовалась для создания тестов перестановочного многомерного дисперсионного анализа (PERMANOVA) для каждой матрицы расстояний, а функция betadisper Вегана использовалась для расчета и сравнения бета-дисперсии с использованием метода ANOVA. Для создания графиков использовался пакет R.

Статистический анализ Нормальность количественных переменных проверяли перед выполнением анализа. Нормальность переменных проверяли путем проверки их гистограмм, графиков Q-Q и/или оценки их асимметрии и эксцесса. Для непрерывных переменных и окончательных результатов мы использовали t-критерий независимых выборок. Те переменные, которые не соответствовали нормальному шаблону распределения, оценивались с использованием непараметрических тестов. Среднее потребление каждого вида мяса использовалось для классификации людей на категории с высоким и низким потреблением, что позволило нам изолировать влияние конкретных кусков мяса. В группе без ожирения потребление белого мяса было классифицировано как потребление белого мяса с высоким содержанием белого мяса (HWM), n = 32, или с низким содержанием белого мяса (LWM), n = 16, в зависимости от того, было ли оно выше или ниже 34 граммов белого мяса на человека. 1000 калорий. Люди с низким весом (n = 16) и люди с высоким весом (n = 28) были идентифицированы на основании того, было ли их потребление на уровне или выше рекомендуемого уровня 25 граммов белка на 1000 калорий.

Группа без ожирения была далее разделена на группу с высоким потреблением красного мяса (HRM), n = 21, и группу с низким потреблением красного мяса (LRM), n = 27, в зависимости от потребления красного мяса. В популяции с ожирением высокое потребление красного мяса определялось как (HRM, n = 14), а низкое потребление красного мяса определялось как (LRM, n = 30).

Мясо (всего и по видам) и кишечную флору коррелировали с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Перед выполнением каких-либо параметрических тестов каждая ненормальная переменная была преобразована. О расчетной статистической значимости сообщалось с использованием p-значения 0,05 и 95% ДИ. Кроме того, критическое значение Бенджамини-Хохберга было рассчитано для каждой корреляции с коэффициентом ложного обнаружения 0,25. Для анализа использовался статистический пакет International Business Machines (IBM) для социальных наук (SPSS) для Windows (версия 24; IBM Corp., Нью-Йорк, США).

В этом исследовании использовалось приложение CosmosID для сравнения микробиоты кишечника людей, страдающих ожирением, и людей, не страдающих ожирением, а также тех, кто был стратифицирован по процентному содержанию жира в организме и соотношению окружности талии и бедер, чтобы определить, существует ли корреляция. между типами и количеством мяса, которое они ели, и их ожирением. Сосредоточив внимание на изменчивости в пределах одной выборки, мы использовали критерий Шеннона для измерения альфа-разнообразия, который изображает распределение обилия видов в конкретной выборке в виде числа, которое зависит от равномерности и богатства видов. Брея-Кертиса использовали для анализа степени сходства или различия между образцами на предмет бета-разнообразия.