Påvirkning av fett og andre faktorer på sammensetningen av tarmmikrobiota

Materialer og metoder

Studere design

Fra januar 2019 til mars 2020 ble en større studie utført i College of Applied Medical Sciences-klinikken som ligger på campus ved King Saud University i Riyadh. Denne forskningen vil være en del av den større studien. Hovedformålet med denne forskningen er å undersøke arten av sammenhengen som eksisterer mellom mikrobiotaen i magen og fedmemarkører. Studiens metodikk er beskrevet i detalj andre steder. Prøvestørrelsen på 92 ble bestemt på en måte som ligner på en tidligere studie, med signifikansnivået satt til 5 % og kraften satt til 80 %, basert på sammensetningen av tarmmikrobiotaen og dens forskjeller blant saudiske kvinner i høyere utdanning. Med et 95 % konfidensintervall (CI) og 80 % kraft, forventer vi en Firmicutes: Bacteroidetes på 0,9:0,4 hos kvinner med normal vekt og 1,7:1,7 hos kvinner med fedme. Folk ble også vervet tilfeldig ved å bruke løpesedler, fakultetshjelp, presentasjoner og sosiale medier. Deltakere med følgende ekskluderingskriterier ble ikke inkludert i analysen: alder 18 år, overvekt, kroppsmasseindeks (BMI) 25-29,9 kg/m2), å være gravid, følge en bestemt diett (f.eks. en kaloribegrenset diett), rapportere tilstedeværelse av gastrointestinale sykdommer de siste åtte ukene, en historie med endokrin eller onkologisk sykdom, psykiatriske lidelser, anoreksi, andre medisinske tilstander , eller ved å bruke multivitaminer, vitamin B.

Hver deltaker fikk et klokkeslett og en dato for å returnere en avføringsprøve til ernæringsklinikken på samme høgskole der studien ble utført, sammen med en beholder som den kunne oppbevares i til det tidspunktet. Deltakerne ga fastende blodprøver og fikk registrert demografisk, ernæringsmessig og antropometrisk informasjon. Nittito saudiske kvinnelige studenter mellom 18 og 25 år utgjorde det endelige utvalget, og de ble delt inn i to grupper: de med fedme (BMI 30 kg/m2) (n=44) og de uten (BMI=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). King Khalid University Hospital Institutional Review Board Committee ved King Saud University ga sin godkjenning til studiens protokoll (IRB #E-19-3625).

Antropometriske målinger

Målinger av fagets antropometri ble tatt av kvalifisert personell ved bruk av etablerte protokoller. De samme målingene ble tatt to ganger, og resultatene fra den andre registreringen ble beregnet som gjennomsnitt for den endelige studien. Forsøkspersonens høyde og vekt ble målt på en internasjonal standardskala og dokumentert til nærmeste henholdsvis 0,10 kg og 0,50 cm. Vekten til forsøkspersonen ble bestemt og dokumentert til nærmeste 0,10 kg (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). For å beregne en persons BMI tok vi vekten i kilogram og delte den på kvadratet av høyden i meter. Resultatet var BMI. Verdens helseorganisasjon (WHO) spesifiserte gjennomsnittsvekt til å ha en kroppsmasseindeks (BMI) mellom 18,50 og 24,99 kilo per kvadratmeter, mens overvekt ble definert til å ha en BMI på mer enn 30 kilo per kvadratmeter.

Individets midje ble målt med et bånd som ikke strakte seg, og hofteomkretsen ble også målt med samme bånd. Målingen av hofteomkretsen ble tatt på det punktet på kroppen der den store trochanteren var størst, mens målingen av midjeomkretsen ble tatt på det punktet på kroppen hvor den laveste ribben og navlen var på det smaleste. Begge målingene ble oppnådd med en nøyaktighet på innenfor 0,50 centimeter. For å beregne midje-hofte-forholdet (WHR) tok vi først gjennomsnittlig midjeomkrets og delte den på gjennomsnittlig hofteomkrets. Resultatene ble deretter sortert i følgende kategorier: i) en normal WHR mindre enn 0,83 og (ii) høy ≥0,83 WHR. Tilnærmingen til bioelektrisk impedansanalyse (BIA) ble brukt for å skaffe informasjon om ens kroppssammensetning, nemlig deres kroppsfettprosent (BF%) og deres muskelmasse (770 BIA; I kroppen, Seoul, Sør-Korea). Kategoriene er som følger: (i) normal ≤35 %; og (ii) Høy >35 % BF %.

Kostholdsdata

I løpet av et guidet intervju samlet profesjonelle ernæringsfysiologer inn kostholdsinformasjon fra deltakerne. For å evaluere forsøkspersonenes matinntak, ble en validert versjon av Food Frequency Questionnaire (FFQ) brukt av Saudi Food and Drug Authority. Deltakerne ble spurt om mengden av hver matvare som de spiste i løpet av året før.

Avføringsanalyse

Umiddelbart etter innsamling ble hver avføringsprøve umiddelbart plassert i beholdere som ikke kunne lekke luft og hadde lokk som passet godt før de ble frosset ved -80 grader Celsius. Deretter ble materialene fraktet til forskningsanlegget, hvor de ble oppbevart i en fryser ved en temperatur på -80 grader Celsius inntil videre undersøkelse. Deretter ble DNA-settet brukt for å ekstrahere DNA fra alikvoter på 0,25 g frossen avføring (Katalog: 12830-50). Vi brukte et Nano-dråpespektrofotometer for å vurdere konsentrasjonen av det ekstraherte DNAet så vel som dets renhet (forholdet 260 til 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

Det ble bestemt at DNA-konsentrasjonen enten var større enn eller lik 1,60. For å konstruere biblioteker ble hver prøve først tildelt et sett med kombinatoriske doble indekser, og deretter gikk den gjennom totalt 12 runder med Polymerase Chain Reaction (PCR). Helgenomets metagenomiske sekvenseringsteknikk ble brukt til å identifisere det totale bakterielle DNA så vel som DNA fra Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia og Fusobacteria. Denne informasjonen ble deretter sendt til CosmosID i USA, for å bestemme sammensetningen av tarmmikrobiotaen på nivået til den viktigste mikrobielle phylaen.

Bioinformatikkmetoder

Det ble tidligere beskrevet at de umonterte sekvenseringsavlesningene ble direkte evaluert av CosmosID bioinformatikkplattformen (som eies og drives av CosmosID Inc. i Maryland). Dette ble utført for å foreta en undersøkelse av mikrobiomet til flere riker, profilere genene som er ansvarlige for antibiotikaresistens og virulens, og måle den relative forekomsten av ulike organismer.

Alfa-diversitet Overflodspoengmatrisene ved fylum, slekt, arter og stammenivåer ble brukt til å lage alfa-diversitetsplott i CosmosID-analysen. Vegan er en R-pakke som gjør det mulig å beregne Chao, Simpson og Shannon alpha, tre mål på mangfold. Ved å bruke R-pakken gjennomførte vi Wilcoxon Rank-Sum-tester for å sammenligne gruppene. R-pakken ble brukt til å lage plott med p-verdi overlegg.

Beta Diversity Principal Coordinate Analyser (PCoA) ble beregnet ved hjelp av fylum, slekt, arter og stammenivåmatriser for bakterier hentet fra CosmosID for å generere beta-diversitet PCoAer. Rs veganske pakkes funksjon ble brukt til å bestemme Bray-Curtis-forskjellen mellom grupper, mens apes PCoA-funksjon ble brukt til å konstruere PCoA-tabeller. Vegans adonis2-funksjon ble brukt til å generere permutasjonell multivariat variansanalyse (PERMANOVA) for hver avstandsmatrise, og vegan sin betadisperger-funksjon ble brukt til å beregne og sammenligne beta-spredning ved bruk av ANOVA-metoden. R-pakken ble brukt til å generere plottene.

Statistisk analyse Normaliteten til de kvantitative variablene ble kontrollert før analysen ble utført. Variablenes normalitet ble sjekket ved å inspisere deres histogrammer, Q-Q plott og/eller vurdere skjevheten og kurtose. For kontinuerlige variabler og endelige resultater brukte vi den uavhengige prøvens t-test. De variablene som ikke fulgte et normalt distribusjonsmønster ble evaluert ved hjelp av ikke-parametriske tester. Medianinntaket av hver type kjøtt ble brukt til å klassifisere personer i høy- og lavinntakskategorier, slik at vi kan isolere effekten av spesifikke kjøttstykker. I den ikke-overvektige gruppen ble inntak av hvitt kjøtt kategorisert som høyt hvitt kjøtt (HWM), n=32 eller lite hvitt kjøtt (LWM), n=16 basert på om det var over eller under 34 gram hvitt kjøtt pr. 1000 kalorier. Personer med lav vekt (n=16) og høyvektsindivider (n=28) ble identifisert basert på om inntaket deres var på eller over det anbefalte nivået på 25 gram protein per 1000 kalorier.

Den ikke-overvektige gruppen ble videre delt inn i de med høyt inntak av rødt kjøtt (HRM), n=21 og de med lavt inntak av rødt kjøtt (LRM), n=27 basert på inntak av rødt kjøtt. I den overvektige befolkningen ble høyt forbruk av rødt kjøtt definert som (HRM, n=14) og lavt forbruk av rødt kjøtt ble definert som (LRM, n=30).

Kjøtt (totalt og etter slag) og tarmflora ble korrelert ved å bruke Pearson-korrelasjonskoeffisienten. Før du gjorde noen parametriske tester, ble hver ikke-normal variabel transformert. Estimert statistisk signifikans ble rapportert ved bruk av en p-verdi på 0,05 og en 95 % KI. Videre ble den kritiske verdien for Benjamini-Hochberg beregnet for hver korrelasjon ved en falsk oppdagelsesrate på 0,25. International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics-versjon for Windows ble brukt til analysen (versjon 24; IBM Corp., New York, USA).

Denne studien brukte CosmosID-applikasjonen for å sammenligne tarmmikrobiotaen til personer som var overvektige og de som ikke var overvektige, samt de som var lagdelt etter kroppsfettprosent og midje-til-hofte-forhold, for å finne ut om det var en korrelasjon mellom typene og mengden kjøtt de spiste og deres fedme. Vi konsentrerte oss om variasjon innenfor en enkelt prøve, og brukte Shannon-testen for å måle alfa-diversitet, som viser fordelingen av artsmengder i en bestemt prøve som et tall som avhenger av artens jevnhet og rikdom. Bray-Curtis ble brukt til å analysere graden av likhet eller ulikhet mellom prøver for beta-mangfold.