Inverkan av fett och andra faktorer på tarmmikrobiotans sammansättning

Material och metoder

Studera design

Från januari 2019 till mars 2020 genomfördes en större studie på College of Applied Medical Sciences klinik på campus vid King Saud University i Riyadh. Denna forskning kommer att vara en del av den större studien. Det primära syftet med denna forskning är att undersöka vilken typ av samband som finns mellan mikrobiotan i magen och fetmamarkörer. Studiens metodik beskrivs i detalj på annat håll. Provstorleken på 92 bestämdes på ett sätt som liknar en tidigare studie, med signifikansnivån satt till 5% och kraften satt till 80%, baserat på sammansättningen av tarmmikrobiotan och dess skillnader bland saudiska kvinnor i högre utbildning. Med ett 95 % konfidensintervall (CI) och 80 % kraft förväntar vi oss en Firmicutes: Bacteroidetes på 0,9:0,4 hos kvinnor med normal vikt och 1,7:1,7 hos kvinnor med fetma. Människor värvades också slumpmässigt med hjälp av flygblad, fakultetshjälp, presentationer och sociala medier. Deltagare med följande uteslutningskriterier inkluderades inte i analysen: ålder 18 år, övervikt, body mass index (BMI) 25-29,9 kg/m2), att vara gravid, följa en specifik diet (t.ex. en kaloribegränsad diet), rapportera närvaron av gastrointestinala sjukdomar under de senaste åtta veckorna, en historia av endokrina eller onkologiska sjukdomar, psykiatriska störningar, anorexi, andra medicinska tillstånd eller genom att använda multivitaminer, vitamin B.

Varje deltagare fick en tid och ett datum för att returnera ett avföringsprov till näringskliniken på samma högskola där studien genomfördes, tillsammans med en behållare för att förvara det tills dess. Deltagarna gav fastande blodprover och fick sin demografiska, näringsmässiga och antropometriska information registrerad. Nittiotvå saudiska kvinnliga studenter mellan 18 och 25 år utgjorde det slutliga urvalet och de delades in i två grupper: de med fetma (BMI 30 kg/m2) (n=44) och de utan (BMI=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). King Khalid University Hospital Institutional Review Board Committee vid King Saud University gav sitt tillstånd till studiens protokoll (IRB #E-19-3625).

Antropometriska mått

Mätningar av försökspersonens antropometri gjordes av kvalificerad personal med hjälp av etablerade protokoll. Samma mätningar gjordes två gånger och resultaten från den andra registreringen togs som medelvärde för den slutliga studien. Försökspersonens längd och vikt mättes på en internationell standardskala och dokumenterades till närmaste 0,10 kg respektive 0,50 cm. Vikten av försökspersonen bestämdes och dokumenterades till närmaste 0,10 kg (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). För att beräkna en individs BMI tog vi deras vikt i kilogram och dividerade den med kvadraten på deras längd i meter. Resultatet blev BMI. Världshälsoorganisationen (WHO) specificerade medelvikten som att ha ett kroppsmassaindex (BMI) mellan 18,50 och 24,99 kilogram per kvadratmeter, medan fetma definierades som att ha ett BMI på mer än 30 kilogram per kvadratmeter.

Individens midja mättes med en tejp som inte sträckte sig, och deras höftomkrets mättes också med samma tejp. Mätningen av höftomkretsen gjordes vid den punkt på kroppen där den stora trochantern var som störst, medan mätningen av midjeomkretsen togs vid den punkt på kroppen där det lägsta revbenet och naveln var som smalast. Båda mätningarna erhölls med en noggrannhet inom 0,50 centimeter. För att beräkna midje-höftförhållandet (WHR) tog vi först midjans genomsnittliga omkrets och dividerade den med höfternas genomsnittliga omkrets. Resultaten sorterades sedan i följande kategorier: i) en normal WHR mindre än 0,83 och (ii) hög ≥0,83 WHR. Metoden för bioelektrisk impedansanalys (BIA) användes för att få information om ens kroppssammansättning, nämligen deras kroppsfettprocent (BF%) och deras muskelmassa (770 BIA; I kroppen, Seoul, Sydkorea). Kategorierna är följande: (i) normal ≤35 %; och (ii) Hög >35% BF%.

Kostdata

Under loppet av en guidad intervju samlade professionella dietister in kostinformation från deltagarna. För att utvärdera försökspersonernas matintag användes en validerad version av Food Frequency Questionnaire (FFQ) av Saudi Food and Drug Authority. Deltagarna tillfrågades om mängden av varje livsmedel som de konsumerade under det föregående året.

Avföringsanalys

Omedelbart efter insamling placerades varje avföringsprov omedelbart i behållare som inte kunde läcka luft och hade lock som passade säkert innan de frystes vid -80 grader Celsius. Därefter transporterades materialen till forskningsanläggningen där de förvarades i en frys vid en temperatur av -80 grader Celsius tills vidare undersökning. Därefter användes DNA-kitet för att extrahera DNA från alikvoter om 0,25 g fryst avföring (Katalog: 12830-50). Vi använde en Nano-drop-spektrofotometer för att bedöma koncentrationen av det extraherade DNA:t såväl som dess renhet (förhållandet 260 till 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

Det fastställdes att DNA-koncentrationen var antingen större än eller lika med 1,60. För att konstruera bibliotek tilldelades varje prov först en uppsättning av kombinatoriska dubbla index, och sedan gick det igenom totalt 12 omgångar av polymeraskedjereaktion (PCR). Helgenomets metagenomiska sekvenseringsteknik användes för att identifiera det totala bakteriella DNA såväl som DNA från Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia och Fusobacteria. Denna information skickades sedan till CosmosID i USA, för att bestämma sammansättningen av tarmmikrobiotan på nivån av den huvudsakliga mikrobiella filan.

Bioinformatikmetoder

Det beskrevs tidigare att de omonterade sekvenseringsläsningarna direkt utvärderades av CosmosID bioinformatikplattform (som ägs och drivs av CosmosID Inc. i Maryland). Detta gjordes för att genomföra en undersökning av mikrobiomet i flera riken, profilera de gener som är ansvariga för antibiotikaresistens och virulens, och mäta den relativa förekomsten av olika organismer.

Alfa-mångfald Matriserna för abundanspoäng vid fylum, släkte, arter och stamnivåer användes för att skapa alfa-diversitetsdiagram i CosmosID-analysen. Vegan är ett R-paket som möjliggör beräkning av Chao, Simpson och Shannon alfa, tre mått på mångfald. Med R-paketet genomförde vi Wilcoxon Rank-Sum-tester där vi jämförde grupperna. R-paketet användes för att skapa plotter med p-värdesöverlagring.

Beta Diversity Principal Coordinate Analyser (PCoA) beräknades med hjälp av fylum, genus, arter och stamnivåmatriser för bakterier erhållna från CosmosID för att generera beta-diversitet PCoA. R:s veganpakets funktion användes för att bestämma Bray-Curtis-skillnaden mellan grupper, medan apes PCoA-funktion användes för att konstruera PCoA-tabeller. Vegans adonis2-funktion användes för att generera Permutational multivariate variansanalys (PERMANOVA) tester för varje distansmatris, och vegan's betadisper-funktion användes för att beräkna och jämföra beta-spridning med ANOVA-metoden. R-paketet användes för att generera plotten.

Statistisk analys Normaliteten hos de kvantitativa variablerna kontrollerades innan analysen utfördes. Variablernas normalitet kontrollerades genom att inspektera deras histogram, Q-Q plots och/eller bedöma deras skevhet och kurtos. För kontinuerliga variabler och slutresultat använde vi det oberoende provets t-test. De variabler som inte följde ett normalfördelningsmönster utvärderades med hjälp av icke-parametriska tester. Medianintaget av varje typ av kött användes för att klassificera människor i högt och lågt intagskategorier, vilket gjorde att vi kunde isolera effekterna av specifika köttstycken. I den icke-överviktiga gruppen kategoriserades konsumtionen av vitt kött som högt vitt kött (HWM), n=32 eller lågt vitt kött (LWM), n=16 baserat på om det var över eller under 34 gram vitt kött pr. 1 000 kalorier. Lågviktiga individer (n=16) och högviktiga individer (n=28) identifierades baserat på om deras intag låg på eller över den rekommenderade nivån på 25 gram protein per 1 000 kalorier.

Den icke-överviktiga gruppen delades vidare in i de med ett högt intag av rött kött (HRM), n=21 och de med ett lågt intag av rött kött (LRM), n=27 baserat på deras rött köttkonsumtion. I den överviktiga befolkningen definierades hög konsumtion av rött kött som (HRM, n=14) och låg konsumtion av rött kött som (LRM, n=30).

Kött (totalt och per slag) och tarmflora korrelerades med Pearsons korrelationskoefficient. Innan några parametriska tester gjordes, transformerades varje icke-normal variabel. Uppskattad statistisk signifikans rapporterades med ett p-värde på 0,05 och ett 95 % KI. Vidare beräknades det kritiska värdet för Benjamini-Hochberg för varje korrelation vid en falsk upptäcktshastighet på 0,25. International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics-version för Windows användes för analysen (version 24; IBM Corp., New York, USA).

Denna studie använde CosmosID-applikationen för att jämföra tarmmikrobiotan hos personer som var överviktiga och de som inte var överviktiga, såväl som de som var stratifierade efter deras kroppsfettprocent och midja-till-höft-förhållande, för att avgöra om det fanns en korrelation mellan de typer och mängder kött de åt och deras fetma. Vi koncentrerade oss på variation inom ett enda prov och använde Shannon-testet för att mäta alfadiversitet, som visar fördelningen av artöverflöd i ett visst prov som ett antal som beror på artens jämnhet och rikedom. Bray-Curtis användes för att analysera graden av likhet eller olikhet mellan prover för beta-diversitet.