Influencia de la adiposidad y otros factores en la composición de la microbiota intestinal

Materiales y métodos

Diseño del estudio

Desde enero de 2019 hasta marzo de 2020, se llevó a cabo un estudio más amplio en la clínica de la Facultad de Ciencias Médicas Aplicadas ubicada en el campus de la Universidad King Saud en Riyadh. Esta investigación será un componente de ese estudio más amplio. El propósito principal de esta investigación es investigar la naturaleza de la conexión que existe entre la microbiota en el estómago y los marcadores de obesidad. La metodología del estudio se describe en detalle en otra parte. El tamaño de la muestra de 92 se determinó de manera similar a un estudio anterior, con un nivel de significancia establecido en 5 % y un poder establecido en 80 %, en función de la composición de la microbiota intestinal y sus diferencias entre las mujeres saudíes en la educación superior. Con un intervalo de confianza (IC) del 95% y una potencia del 80%, esperamos un Firmicutes: Bacteroidetes de 0,9:0,4 en mujeres de peso normal y 1,7:1,7 en mujeres con obesidad. Además, las personas se enlistaron al azar usando volantes, ayuda de profesores, presentaciones y redes sociales. Los participantes con los siguientes criterios de exclusión no se incluyeron en el análisis: edad 18 años, sobrepeso, índice de masa corporal (IMC) 25-29.9 kg/m2), estar embarazada, seguir una dieta específica (por ejemplo, una dieta restringida en calorías), informar la presencia de enfermedades gastrointestinales en las últimas ocho semanas, antecedentes de enfermedad endocrina u oncológica, trastornos psiquiátricos, anorexia, otras condiciones médicas , o usando multivitaminas, vitamina B.

A cada participante se le dio una hora y fecha para devolver una muestra de heces a la clínica de nutrición de la misma Facultad donde se realizó el estudio, junto con un recipiente para almacenarla hasta ese momento. Los participantes proporcionaron muestras de sangre en ayunas y se registró su información demográfica, nutricional y antropométrica. Noventa y dos estudiantes saudíes de entre 18 y 25 años conformaron la muestra final, y se dividieron en dos grupos: las que tenían obesidad (IMC 30 kg/m2) (n=44) y las que no (IMC=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). El Comité de la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario King Khalid de la Universidad King Saud dio su aprobación al protocolo del estudio (IRB #E-19-3625).

Medidas Antropométricas

Las mediciones de la antropometría del sujeto fueron tomadas por personal calificado utilizando protocolos establecidos. Se tomaron dos veces las mismas medidas y se promediaron los resultados del segundo registro para el estudio final. La altura y el peso del sujeto se midieron en una escala estándar internacional y se documentaron con una precisión de 0,10 kg y 0,50 cm, respectivamente. El peso del sujeto se determinó y documentó con una precisión de 0,10 kg (Digital Pearson Scale; Oxford, EE. UU.). Para calcular el IMC de una persona, tomamos su peso en kilogramos y lo dividimos por el cuadrado de su altura en metros. El resultado fue el IMC. La Organización Mundial de la Salud (OMS) especificó que el peso promedio tenía un índice de masa corporal (IMC) entre 18,50 y 24,99 kilogramos por metro cuadrado, mientras que el peso obeso se definió como un IMC de más de 30 kilogramos por metro cuadrado.

La cintura del individuo se midió con una cinta que no se estiraba, y también se midió la circunferencia de la cadera con la misma cinta. La medida de la circunferencia de la cadera se tomó en el punto del cuerpo donde el trocánter mayor estaba en su punto más grande, mientras que la medida de la circunferencia de la cintura se tomó en el punto del cuerpo donde la costilla inferior y el ombligo estaban en su punto más estrecho. Ambas medidas se obtuvieron con una precisión de 0,50 centímetros. Para calcular la relación cintura-cadera (WHR), primero tomamos la circunferencia promedio de la cintura y la dividimos por la circunferencia promedio de las caderas. Luego, los resultados se clasificaron en las siguientes categorías: i) un WHR normal inferior a 0,83 y (ii) alto ≥0,83 WHR. Se utilizó el enfoque de análisis de impedancia bioeléctrica (BIA) para adquirir información sobre la composición corporal, es decir, su porcentaje de grasa corporal (BF%) y su masa muscular (770 BIA; en el cuerpo, Seúl, Corea del Sur). Las categorías son las siguientes: (i) normal ≤35%; y (ii) Alto >35% BF%.

Datos dietéticos

Durante el transcurso de una entrevista guiada, dietistas profesionales recopilaron información dietética de los participantes. Para evaluar la ingesta de alimentos de los sujetos, la Autoridad de Alimentos y Medicamentos de Arabia Saudita utilizó una versión validada del Cuestionario de frecuencia de alimentos (FFQ). Se preguntó a los participantes sobre la cantidad de cada alimento que consumieron a lo largo del año anterior.

Análisis de las heces

Inmediatamente después de la recolección, cada muestra de heces se colocó inmediatamente en recipientes que no podían perder aire y tenían tapas que se ajustaban de forma segura antes de congelarse a -80 grados centígrados. Después de eso, los materiales se transportaron al centro de investigación, donde se mantuvieron en un congelador a una temperatura de -80 grados centígrados hasta su posterior examen. Posteriormente, se utilizó el Kit de ADN para extraer ADN de alícuotas de 0,25 g de heces congeladas (Catálogo: 12830-50). Utilizamos un espectrofotómetro Nano-drop para evaluar la concentración del ADN extraído, así como su pureza (la proporción de 260 a 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.).

Se determinó que la concentración de ADN era mayor o igual a 1,60. Para construir bibliotecas, a cada muestra se le asignó primero un conjunto de índices duales combinatorios y luego pasó por un total de 12 rondas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizó la técnica de secuenciación metagenómica del genoma completo para identificar el ADN bacteriano total, así como el ADN de Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia y Fusobacteria. Luego, esta información se envió a CosmosID en los Estados Unidos, para determinar la composición de la microbiota intestinal a nivel de los principales filos microbianos.

Métodos de bioinformática

Se describió anteriormente que las lecturas de secuenciación sin ensamblar fueron evaluadas directamente por la plataforma bioinformática CosmosID (que es propiedad y está operada por CosmosID Inc. en Maryland). Esto se llevó a cabo para llevar a cabo un examen del microbioma de múltiples reinos, perfilar los genes responsables de la resistencia y virulencia a los antibióticos, y medir la abundancia relativa de varios organismos.

Diversidad alfa Las matrices de puntuación de abundancia en los niveles de phylum, género, especie y cepa se utilizaron para crear gráficas de diversidad alfa en el análisis de CosmosID. Vegan es un paquete R que permite el cálculo de Chao, Simpson y Shannon alpha, tres medidas de diversidad. Usando el paquete R, realizamos pruebas de Wilcoxon Rank-Sum comparando los grupos. El paquete R se utilizó para crear gráficos con superposición de valor p.

Los análisis de coordenadas principales (PCoA) de diversidad beta se calcularon utilizando matrices de filo, género, especie y nivel de cepa para bacterias obtenidas de CosmosID para generar PCoA de diversidad beta. La función del paquete vegano de R se usó para determinar la disimilitud de Bray-Curtis entre grupos, mientras que la función PCoA de mono se usó para construir tablas de PCoA. Se usó la función adonis2 de Vegan para generar pruebas de análisis de varianza permutacional multivariado (PERMANOVA) para cada matriz de distancia, y se usó la función betadisper de Vegan para calcular y comparar la dispersión beta usando el método ANOVA. Se utilizó el paquete R para generar los gráficos.

Análisis estadístico Se comprobó la normalidad de las variables cuantitativas antes de realizar el análisis. La normalidad de las variables se comprobó inspeccionando sus histogramas, gráficos Q-Q y/o evaluando su asimetría y curtosis. Para las variables continuas y los resultados finales, empleamos la prueba t de muestras independientes. Aquellas variables que no siguieron un patrón de distribución normal se evaluaron mediante pruebas no paramétricas. La ingesta mediana de cada tipo de carne se utilizó para clasificar a las personas en categorías de ingesta alta y baja, lo que nos permitió aislar los efectos de cortes de carne específicos. En el grupo de no obesos, el consumo de carne blanca se clasificó como alto en carne blanca (HWM), n=32 o bajo en carne blanca (LWM), n=16 en función de si estaba por encima o por debajo de los 34 gramos de carne blanca por persona. 1.000 calorías. Se identificaron individuos de bajo peso (n = 16) y de alto peso (n = 28) en función de si su ingesta estaba o no en el nivel recomendado de 25 gramos de proteína por cada 1000 calorías.

El grupo no obeso se dividió en aquellos con un alto consumo de carne roja (HRM), n = 21 y aquellos con un bajo consumo de carne roja (LRM), n = 27 en función de su consumo de carne roja. En la población obesa se definió como alto consumo de carne roja (HRM, n=14) y bajo consumo de carne roja (LRM, n=30).

La carne (total y por tipo) y la flora intestinal se correlacionaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Antes de realizar cualquier prueba paramétrica, se transformó cada variable no normal. La significación estadística estimada se informó mediante un valor de p de 0,05 y un IC del 95 %. Además, se calculó el valor crítico de Benjamini-Hochberg para cada correlación con una tasa de descubrimiento falso de 0,25. Para el análisis se utilizó el paquete estadístico International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión para Windows (versión 24; IBM Corp., Nueva York, EE. UU.).

Este estudio utilizó la aplicación CosmosID para comparar la microbiota intestinal de personas obesas y no obesas, así como aquellas que fueron estratificadas por su porcentaje de grasa corporal y la relación cintura-cadera, para determinar si había una correlación. entre los tipos y cantidades de carne que comían y su obesidad. Concentrándonos en la variación dentro de una sola muestra, empleamos la prueba de Shannon para medir la diversidad alfa, que representa la distribución de la abundancia de especies en una muestra particular como un número que depende de la uniformidad y riqueza de las especies. Se utilizó Bray-Curtis para analizar el grado de similitud o disimilitud entre las muestras para la diversidad beta.