A zsírosodás és egyéb tényezők hatása a bél mikrobiota összetételére

Anyagok és metódusok

Dizájnt tanulni

2019 januárja és 2020 márciusa között egy nagyobb tanulmányt végeztek az Alkalmazott Orvostudományi Főiskola klinikáján, amely a rijádi King Saud Egyetem campusán található. Ez a kutatás ennek a nagyobb tanulmánynak a része lesz. A kutatás elsődleges célja a gyomorban lévő mikrobiota és az elhízás markerek közötti kapcsolat természetének vizsgálata. A tanulmány módszertanát máshol részletesen ismertetjük. A 92 fős mintanagyságot egy korábbi vizsgálathoz hasonló módon határozták meg, a szignifikanciaszintet 5%-ban, a teljesítményt pedig 80%-ban határozták meg a bélmikrobióta összetétele és a felsőoktatásban tanuló szaúdi nők közötti különbségek alapján. 95%-os bizalmi intervallummal (CI) és 80%-os teljesítménnyel a normál testsúlyú nőknél 0,9:0,4 és az elhízott nőknél 1,7:1,7 Firmicutes: Bacteroidetes értékre számítunk. Ezenkívül az embereket véletlenszerűen besorozták szórólapok, tanári segédanyagok, prezentációk és közösségi média segítségével. A következő kizáró kritériumokkal rendelkező résztvevők nem kerültek be az elemzésbe: életkor 18 év, túlsúly, testtömeg-index (BMI) 25-29,9 kg/m2), terhes, meghatározott diétát (pl. kalóriaszegény diétát) követ, gyomor-bélrendszeri betegségek jelenlétét jelentette az elmúlt nyolc hétben, endokrin vagy onkológiai betegség a kórtörténetében, pszichiátriai rendellenességek, étvágytalanság, egyéb egészségügyi állapotok , vagy multivitaminok, B-vitamin használatával.

Minden résztvevő egy időpontot és dátumot kapott, hogy visszaküldje a székletmintát a vizsgálatot végző főiskola táplálkozási klinikájára, valamint egy tárolóedényt, amelyben addig tárolta. A résztvevők éhgyomri vérmintákat adtak, és feljegyezték demográfiai, táplálkozási és antropometriai adataikat. Kilencvenkét, 18 és 25 év közötti szaúdi diáklány alkotta a végső mintát, akiket két csoportra osztottak: elhízottakra (BMI 30 kg/m2) (n=44) és nem (BMI=18,50-) 24.99 kg/m2) (n=48). A King Khalid Egyetemi Kórház Intézményi Felülvizsgálati Bizottsága, a King Saud University jóváhagyta a vizsgálati protokollt (IRB #E-19-3625).

Antropometriai mérések

Az alany antropometriájának mérését szakképzett személyzet végezte a megállapított protokollok alkalmazásával. Ugyanazokat a méréseket kétszer végeztük, és a második felvétel eredményeit átlagoltuk a végső vizsgálathoz. Az alany magasságát és súlyát nemzetközi szabványos skálán mérték, és 0,10 kg, illetve 0,50 cm pontossággal dokumentálták. Az alany súlyát 0,10 kg pontossággal meghatároztuk és dokumentáltuk (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). Az egyén BMI-jének kiszámításához kilogrammban mértük a súlyukat, és elosztottuk a méterben mért magasságuk négyzetével. Az eredmény a BMI lett. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) az átlagos testsúlyt úgy határozta meg, hogy a testtömegindex (BMI) 18,50 és 24,99 kilogramm/négyzetméter között van, az elhízott testtömeg pedig azt, ha a BMI meghaladja a 30 kilogrammot négyzetméterenként.

Az egyén derekát nem nyúló szalaggal mérték, és a csípőkörfogatát is ugyanezzel a szalaggal mérték. A csípő kerületét a test azon a pontján mérték, ahol a nagy trochanter a legnagyobb volt, míg a derékkörfogat a test azon pontján, ahol a legalsó borda és a köldök a legkeskenyebb volt. Mindkét mérés 0,50 centiméteres pontossággal készült. A derék-csípő arány (WHR) kiszámításához először vettük a derék átlagos kerületét, és elosztottuk a csípő átlagos kerületével. Az eredményeket ezután a következő kategóriákba soroltuk: i) a normál WHR kevesebb, mint 0,83 és (ii) a magas ≥0,83 WHR. A bioelektromos impedancia analízis (BIA) módszert alkalmazták arra, hogy információkat szerezzenek a testösszetételről, nevezetesen a testzsír százalékáról (BF%) és az izomtömegükről (770 BIA; In body, Szöul, Dél-Korea). A kategóriák a következők: (i) normál ≤35%; és (ii) magas >35% BF%.

Diétás adatok

Egy irányított interjú során professzionális dietetikusok gyűjtöttek diétás információkat a résztvevőktől. Az alanyok táplálékfelvételének értékelésére a Szaúdi Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság az Élelmiszer-gyakoriság Kérdőív (FFQ) validált változatát használta fel. A résztvevőket megkérdezték az egyes élelmiszerek mennyiségéről, amelyeket az előző év során fogyasztottak.

Székletelemzés

Közvetlenül a begyűjtést követően minden székletmintát azonnal olyan tartályokba helyeztek, amelyekből nem szivároghatott levegő, és amelyek fedelével biztonságosan illeszkedtek, mielőtt -80 Celsius-fokra fagyasztották volna. Ezt követően az anyagokat a kutatóhelyiségbe szállították, ahol további vizsgálatig -80 Celsius fokos fagyasztóban tárolták. Ezt követően a DNS-készletet használták fel a DNS kinyerésére 0,25 g fagyasztott széklet alikvotjaiból (katalógus: 12830-50). Nano-drop spektrofotométert használtunk a kivont DNS koncentrációjának, valamint tisztaságának (260:280 arány) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) értékelésére.

Megállapítottuk, hogy a DNS-koncentráció 1,60-nál nagyobb vagy egyenlő. A könyvtárak létrehozása érdekében minden mintához először egy kombinációs kettős indexet rendeltek, majd összesen 12 polimeráz láncreakció (PCR) körön ment keresztül. A teljes genom metagenomikus szekvenálási technikát alkalmazták a teljes bakteriális DNS, valamint a Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia és Fusobacteria DNS azonosítására. Ezt az információt aztán elküldték az egyesült államokbeli CosmosID-nek, hogy meghatározzák a bélmikrobióta összetételét a fő mikrobiális törzs szintjén.

Bioinformatikai módszerek

Korábban már leírták, hogy az össze nem szerelt szekvenálási leolvasásokat közvetlenül a CosmosID bioinformatikai platform értékelte (amely a marylandi CosmosID Inc. tulajdona és üzemeltetője). Ennek célja több királyság mikrobiomjának vizsgálata, az antibiotikum-rezisztenciáért és virulenciáért felelős gének profilozása, valamint a különböző organizmusok relatív abundanciájának mérése volt.

Alfa-diverzitás A törzs-, nemzetség-, faj- és törzsszintű abundancia-pontszámmátrixokat alfa-diverzitási diagramok létrehozásához használták a CosmosID elemzésben. A Vegan egy R-csomag, amely lehetővé teszi a Chao, Simpson és Shannon alfa kiszámítását, a diverzitás három mértékét. Az R csomag segítségével Wilcoxon Rank-Sum teszteket végeztünk a csoportok összehasonlításával. Az R csomagot használták p-érték átfedéssel rendelkező telkek létrehozására.

A béta-diverzitási főkoordináta-elemzéseket (PCoA) a CosmosID-ből nyert baktériumok törzs-, nemzetség-, faj- és törzsszintű mátrixai segítségével számították ki a béta-diverzitású PCoA-k előállításához. Az R vegán csomag függvényét használták a Bray-Curtis csoportok közötti eltérés meghatározására, míg a majom PCoA függvényét a PCoA táblázatok összeállítására. A vegan adonis2 függvényét használták a permutációs többváltozós varianciaanalízis (PERMANOVA) generálására minden távolságmátrixhoz, a vegán betadisper függvényét pedig a béta-szórás kiszámításához és összehasonlításához az ANOVA módszerrel. Az R csomagot használtuk a telkek generálásához.

Statisztikai analízis A kvantitatív változók normálisságát az elemzés elvégzése előtt ellenőriztük. A változók normalitását hisztogramjaik, Q-Q diagramjaik és/vagy ferdeségük és ferdeségük felmérésével ellenőriztük. A folytonos változókhoz és a végeredményekhez a független minták t-próbáját alkalmaztuk. Azokat a változókat, amelyek nem követtek normális eloszlási mintát, nemparaméteres tesztekkel értékelték ki. Az egyes húsfajták átlagos bevitelét arra használták, hogy az embereket magas és alacsony beviteli kategóriákba sorolják, lehetővé téve az egyes húsdarabok hatásainak elkülönítését. A nem elhízott csoportban a fehérhús-fogyasztást a magas fehérhús (HWM), n=32 vagy alacsony fehérhús (LWM) kategóriába sorolták, n=16 annak alapján, hogy 34 gramm fehér húst tartalmazott-e vagy sem. 1000 kalória. Az alacsony testsúlyú egyéneket (n=16) és a nagy testsúlyú egyéneket (n=28) az alapján azonosították, hogy bevitelük elérte-e vagy meghaladja-e az ajánlott 25 gramm fehérjét 1000 kalóriánként.

A nem elhízott csoportot tovább osztottuk a magas vörös húst (HRM), n=21 fogyasztókra és az alacsony vörös húst fogyasztókra (LRM), n=27 vöröshús-fogyasztásuk alapján. Az elhízott populációban a magas vöröshús-fogyasztást (HRM, n=14), az alacsony vöröshús-fogyasztást pedig (LRM, n=30) értékként határoztuk meg.

A hús (összesen és fajtánként) és a bélflórát Pearson korrelációs együttható segítségével korreláltuk. Mielőtt bármilyen paraméteres tesztet elvégeztünk volna, minden nem normál változót transzformáltunk. A becsült statisztikai szignifikanciát 0,05-ös p-érték és 95%-os CI használatával adtuk meg. Továbbá minden korrelációra kiszámítottuk a Benjamini-Hochberg kritikus értéket 0,25-ös hamis felfedezési arány mellett. Az elemzéshez az International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statisztikai csomag Windows rendszerhez készült verzióját használtuk (24-es verzió; IBM Corp., New York, USA).

Ez a tanulmány a CosmosID alkalmazást használta az elhízott és nem elhízott emberek bélmikrobiótájának összehasonlítására, valamint a testzsírszázalékuk és a derék-csípő arányuk alapján rétegzettek bélmikrobiótájának összehasonlítására, hogy megállapítsa, van-e összefüggés. az elfogyasztott hús típusa és mennyisége, valamint elhízásuk között. Az egyetlen mintán belüli variációra koncentrálva az alfa-diverzitás mérésére a Shannon-tesztet alkalmaztuk, amely egy adott mintában a fajok abundanciájának eloszlását a fajok egyenletességétől és gazdagságától függő számként ábrázolja. Bray-Curtis-t használták a minták közötti hasonlóság vagy eltérés mértékének elemzésére a béta-diverzitás szempontjából.