Influência da adiposidade e outros fatores na composição da microbiota intestinal

Materiais e métodos

Design de estudo

De janeiro de 2019 a março de 2020, um estudo maior foi realizado na clínica da Faculdade de Ciências Médicas Aplicadas localizada no campus da King Saud University em Riad. Esta pesquisa será um componente desse estudo maior. O objetivo principal desta pesquisa é investigar a natureza da conexão que existe entre a microbiota no estômago e os marcadores de obesidade. A metodologia do estudo é descrita em detalhes em outro lugar. O tamanho da amostra de 92 foi determinado de maneira semelhante a um estudo anterior, com o nível de significância definido em 5% e o poder definido em 80%, com base na composição da microbiota intestinal e suas diferenças entre as mulheres sauditas no ensino superior. Com um Intervalo de Confiança (IC) de 95% e poder de 80%, esperamos um Firmicutes: Bacteroidetes de 0,9:0,4 em mulheres com peso normal e 1,7:1,7 em mulheres com obesidade. Além disso, as pessoas foram alistadas aleatoriamente usando folhetos, auxílio do corpo docente, apresentações e mídias sociais. Participantes com os seguintes critérios de exclusão não foram incluídos na análise: idade 18 anos, excesso de peso, índice de massa corporal (IMC) 25-29,9 kg/m2), estar grávida, seguir uma dieta específica (por exemplo, uma dieta de restrição calórica), relatar a presença de doenças gastrointestinais nas últimas oito semanas, história de doença endócrina ou oncológica, distúrbios psiquiátricos, anorexia, outras condições médicas , ou usando multivitaminas, vitamina B.

Cada participante recebeu uma hora e data para devolver uma amostra de fezes ao ambulatório de nutrição da mesma faculdade onde o estudo foi realizado, juntamente com um recipiente para armazená-la até aquele momento. Os participantes forneceram amostras de sangue em jejum e tiveram suas informações demográficas, nutricionais e antropométricas registradas. Noventa e duas alunas sauditas com idades entre 18 e 25 anos compuseram a amostra final e foram divididas em dois grupos: as com obesidade (IMC 30 kg/m2) (n=44) e as sem (IMC=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). O Comitê de Revisão Institucional do King Khalid University Hospital da King Saud University autorizou o protocolo do estudo (IRB #E-19-3625).

Medidas antropométricas

As medições da antropometria do sujeito foram feitas por pessoal qualificado utilizando protocolos estabelecidos. As mesmas medições foram feitas duas vezes, e os resultados da segunda gravação foram calculados para o estudo final. A altura e o peso do indivíduo foram medidos em uma escala padrão internacional e documentados com precisão de 0,10 kg e 0,50 cm, respectivamente. O peso do sujeito foi determinado e documentado com precisão de 0,10 kg (Escala Digital Pearson; Oxford, EUA). Para calcular o IMC de um indivíduo, pegamos seu peso em quilogramas e dividimos pelo quadrado de sua altura em metros. O resultado foi o IMC. A Organização Mundial da Saúde (OMS) especificou o peso médio como tendo um índice de massa corporal (IMC) entre 18,50 e 24,99 quilos por metro quadrado, enquanto o peso obeso foi definido como tendo um IMC superior a 30 quilos por metro quadrado.

A cintura do indivíduo foi medida com uma fita que não esticou, e a circunferência do quadril também foi medida com a mesma fita. A medida da circunferência do quadril foi feita no ponto do corpo onde o grande trocânter era maior, enquanto a medida da circunferência da cintura foi feita no ponto do corpo onde a costela inferior e o umbigo eram mais estreitos. Ambas as medições foram obtidas com uma precisão de 0,50 centímetros. Para calcular a relação cintura-quadril (RCQ), primeiro pegamos a circunferência média da cintura e dividimos pela circunferência média dos quadris. Os resultados foram então classificados nas seguintes categorias: i) RCQ normal inferior a 0,83 e (ii) alta ≥0,83 WHR. A abordagem de análise de impedância bioelétrica (BIA) foi utilizada para adquirir informações sobre a composição corporal de uma pessoa, ou seja, seu percentual de gordura corporal (GC%) e sua massa muscular (770 BIA; In body, Seul, Coréia do Sul). As categorias são as seguintes: (i) normal ≤35%; e (ii) Alta >35% GC%.

Dados dietéticos

Durante uma entrevista guiada, nutricionistas profissionais coletaram informações dietéticas dos participantes. Para avaliar a ingestão alimentar dos indivíduos, uma versão validada do Food Frequency Questionnaire (FFQ) foi utilizada pela Saudi Food and Drug Authority. Os participantes foram questionados sobre a quantidade de cada alimento que consumiram ao longo do ano anterior.

Análise de fezes

Imediatamente após a coleta, cada amostra de fezes foi imediatamente colocada em recipientes que não vazassem ar e tivessem tampas que se encaixassem com segurança antes de serem congeladas a -80 graus Celsius. Depois disso, os materiais foram transportados para o centro de pesquisa, onde foram mantidos em freezer a -80 graus Celsius até análise posterior. Em seguida, utilizou-se o DNA Kit para extrair DNA de alíquotas de 0,25 g de fezes congeladas (Catálogo: 12830-50). Usamos um espectrofotômetro Nano-drop para avaliar a concentração do DNA extraído, bem como sua pureza (a proporção de 260 para 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA).

Foi determinado que a concentração de DNA era maior ou igual a 1,60. Para construir bibliotecas, cada amostra recebeu primeiro um conjunto de índices duplos combinatórios e, em seguida, passou por um total de 12 rodadas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A técnica de sequenciamento metagenômico do genoma inteiro foi usada para identificar o DNA bacteriano total, bem como o DNA de Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia e Fusobacteria. Essas informações foram então enviadas para a CosmosID nos Estados Unidos, a fim de determinar a composição da microbiota intestinal no nível dos principais filos microbianos.

Métodos de Bioinformática

Foi descrito anteriormente que as leituras de sequenciamento desmontadas foram avaliadas diretamente pela plataforma de bioinformática CosmosID (que pertence e é operada pela CosmosID Inc. em Maryland). Isso foi realizado para realizar um exame do microbioma de vários reinos, traçar o perfil dos genes responsáveis ​​pela resistência e virulência a antibióticos e medir a abundância relativa de vários organismos.

Diversidade alfa As matrizes de pontuação de abundância nos níveis de filo, gênero, espécie e linhagem foram usadas para criar gráficos de diversidade alfa na análise do CosmosID. Vegan é um pacote R que permite o cálculo de Chao, Simpson e Shannon alpha, três medidas de diversidade. Utilizando o pacote R, realizamos testes Wilcoxon Rank-Sum comparando os grupos. O pacote R foi utilizado para criar gráficos com sobreposição de valor-p.

As Análises de Coordenada Principal de Diversidade Beta (PCoA) foram computadas usando matrizes de filo, gênero, espécie e nível de cepa para bactérias obtidas do CosmosID para gerar PCoAs de diversidade beta. A função do pacote vegan do R foi usada para determinar a dissimilaridade de Bray-Curtis entre os grupos, enquanto a função PCoA do ape foi usada para construir tabelas PCoA. A função adonis2 de Vegan foi usada para gerar testes de análise de variância multivariada permutacional (PERMANOVA) para cada matriz de distância, e a função betadisper de vegan foi usada para calcular e comparar a dispersão beta usando o método ANOVA. O pacote R foi usado para gerar as parcelas.

Análise estatística A normalidade das variáveis ​​quantitativas foi verificada antes da realização da análise. A normalidade das variáveis ​​foi verificada inspecionando seus histogramas, gráficos Q-Q e/ou avaliando sua assimetria e curtose. Para variáveis ​​contínuas e resultados finais, empregou-se o teste t para amostras independentes. As variáveis ​​que não seguiram um padrão de distribuição normal foram avaliadas por meio de testes não paramétricos. O consumo médio de cada tipo de carne foi usado para classificar as pessoas em categorias de alto e baixo consumo, permitindo isolar os efeitos de cortes específicos de carne. No grupo não obeso, o consumo de carne branca foi categorizado como alto consumo de carne branca (HWM), n = 32 ou baixo consumo de carne branca (LWM), n = 16 com base em se estava acima ou abaixo de 34 gramas de carne branca por 1.000 calorias. Indivíduos de baixo peso (n=16) e indivíduos de alto peso (n=28) foram identificados com base na ingestão ou não no nível recomendado de 25 gramas de proteína por 1.000 calorias.

O grupo não obeso foi ainda dividido naqueles com alta ingestão de carne vermelha (HRM), n = 21 ingestão e aqueles com baixa ingestão de carne vermelha (LRM), n = 27 com base no consumo de carne vermelha. Na população obesa, alto consumo de carne vermelha foi definido como (HRM, n=14) e baixo consumo de carne vermelha foi definido como (LRM, n=30).

A carne (total e por tipo) e a flora intestinal foram correlacionadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. Antes de fazer qualquer teste paramétrico, toda variável não normal foi transformada. A significância estatística estimada foi relatada usando um valor p de 0,05 e um IC de 95%. Além disso, o valor crítico de Benjamini-Hochberg foi calculado para cada correlação com uma taxa de descoberta falsa de 0,25. O International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics versão para Windows foi usado para a análise (versão 24; IBM Corp., Nova York, EUA).

Este estudo usou o aplicativo CosmosID para comparar a microbiota intestinal de pessoas obesas e não obesas, bem como aquelas que foram estratificadas por seu percentual de gordura corporal e relação cintura-quadril, para determinar se havia uma correlação entre os tipos e quantidades de carne que comiam e sua obesidade. Concentrando-se na variação dentro de uma única amostra, empregamos o teste de Shannon para medir a diversidade alfa, que descreve a distribuição da abundância de espécies em uma amostra particular como um número que depende da uniformidade e riqueza de espécies. Bray-Curtis foi usado para analisar o grau de similaridade ou dissimilaridade entre as amostras para a diversidade beta.