Indflydelse af fedt og andre faktorer på tarmmikrobiotasammensætningen

Materialer og metoder

Studere design

Fra januar 2019 til marts 2020 blev en større undersøgelse udført i College of Applied Medical Sciences klinik beliggende på campus ved King Saud University i Riyadh. Denne forskning vil være en del af den større undersøgelse. Det primære formål med denne forskning er at undersøge arten af ​​den sammenhæng, der eksisterer mellem mikrobiotaen i maven og fedmemarkører. Undersøgelsens metodik er beskrevet i detaljer andetsteds. Prøvestørrelsen på 92 blev bestemt på en måde svarende til en tidligere undersøgelse, med signifikansniveauet sat til 5% og magten sat til 80%, baseret på sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen og dens forskelle blandt saudiske kvinder på videregående uddannelser. Med et 95 % konfidensinterval (CI) og 80 % power forventer vi en Firmicutes: Bacteroidetes på 0,9:0,4 hos kvinder med normal vægt og 1,7:1,7 hos kvinder med fedme. Også folk blev optaget tilfældigt ved hjælp af løbesedler, fakultetshjælp, præsentationer og sociale medier. Deltagere med følgende udelukkelseskriterier blev ikke inkluderet i analysen: alder 18 år, overvægt, body mass index (BMI) 25-29,9 kg/m2), er gravid, følger en specifik diæt (f.eks. en kaloriebegrænset diæt), rapporterer tilstedeværelsen af ​​gastrointestinale sygdomme inden for de seneste otte uger, en historie med endokrin eller onkologisk sygdom, psykiatriske lidelser, anoreksi, andre medicinske tilstande , eller ved at bruge multivitaminer, vitamin B.

Hver deltager fik et tidspunkt og en dato for at returnere en afføringsprøve til ernæringsklinikken på det samme kollegium, hvor undersøgelsen blev udført, sammen med en beholder, hvor den kunne opbevares indtil det tidspunkt. Deltagerne gav fastende blodprøver og fik registreret deres demografiske, ernæringsmæssige og antropometriske oplysninger. 92 saudiske kvindelige studerende mellem 18 og 25 år udgjorde den endelige prøve, og de blev opdelt i to grupper: dem med fedme (BMI 30 kg/m2) (n=44) og dem uden (BMI=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). King Khalid University Hospital Institutional Review Board Committee af King Saud University gav sin godkendelse til undersøgelsens protokol (IRB #E-19-3625).

Antropometriske målinger

Målinger af emnets antropometri blev taget af kvalificeret personale ved at bruge etablerede protokoller. De samme målinger blev taget to gange, og resultaterne fra den anden optagelse blev taget som gennemsnit for den endelige undersøgelse. Forsøgspersonens højde og vægt blev målt på en international standardskala og dokumenteret til nærmeste henholdsvis 0,10 kg og 0,50 cm. Individets vægt blev bestemt og dokumenteret til nærmeste 0,10 kg (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). For at beregne en persons BMI tog vi deres vægt i kilogram og dividerede den med kvadratet af deres højde i meter. Resultatet var BMI. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) specificerede gennemsnitsvægten til at have et kropsmasseindeks (BMI) mellem 18,50 og 24,99 kg pr. kvadratmeter, mens overvægtig vægt blev defineret som at have et BMI på mere end 30 kg pr. kvadratmeter.

Individets talje blev målt med et bånd, der ikke strakte sig, og deres hofteomkreds blev også målt med det samme bånd. Målingen af ​​hofteomkredsen blev taget på det punkt på kroppen, hvor den store trochanter var størst, hvorimod målingen af ​​taljeomkredsen blev taget på det punkt på kroppen, hvor det laveste ribben og navlen var smallest. Begge målinger blev opnået med en nøjagtighed på inden for 0,50 centimeter. For at beregne talje-hofte-forholdet (WHR) tog vi først den gennemsnitlige omkreds af taljen og dividerede den med den gennemsnitlige omkreds af hofterne. Resultaterne blev derefter sorteret i følgende kategorier: i) en normal WHR mindre end 0,83 og (ii) høj ≥0,83 WHR. Den bioelektriske impedansanalyse (BIA) tilgang blev brugt til at opnå information om ens kropssammensætning, nemlig deres kropsfedtprocent (BF%) og deres muskelmasse (770 BIA; I kroppen, Seoul, Sydkorea). Kategorierne er som følger: (i) normal ≤35%; og (ii) Høj >35% BF%.

Kostdata

I løbet af et guidet interview indsamlede professionelle diætister kostinformation fra deltagerne. For at evaluere forsøgspersonernes fødeindtag blev en valideret version af Food Frequency Questionnaire (FFQ) brugt af Saudi Food and Drug Authority. Deltagerne blev spurgt om mængden af ​​hver fødevare, som de indtog i løbet af det foregående år.

Analyse af afføring

Umiddelbart efter indsamling blev hver afføringsprøve straks anbragt i beholdere, der ikke kunne lække luft og havde låg, der passede sikkert, før de blev frosset ved -80 grader Celsius. Herefter blev materialerne transporteret til forskningsfaciliteten, hvor de blev opbevaret i en fryser ved en temperatur på -80 grader Celsius indtil videre undersøgelse. Derefter blev DNA-kittet brugt til at ekstrahere DNA fra alikvoter på 0,25 g frossen fæces (Katalog: 12830-50). Vi brugte et Nano-drop spektrofotometer til at vurdere koncentrationen af ​​det ekstraherede DNA såvel som dets renhed (forholdet 260 til 280) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

Det blev bestemt, at DNA-koncentrationen enten var større end eller lig med 1,60. For at konstruere biblioteker blev hver prøve først tildelt et sæt af kombinatoriske dobbeltindekser, og derefter gennemgik den i alt 12 runder af Polymerase Chain Reaction (PCR). Helgenomets metagenomiske sekventeringsteknik blev brugt til at identificere det samlede bakterielle DNA såvel som DNA'et fra Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia og Fusobacteria. Denne information blev derefter sendt til CosmosID i USA for at bestemme sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen på niveau med den primære mikrobielle phyla.

Bioinformatiske metoder

Det blev tidligere beskrevet, at de usamlede sekventeringslæsninger blev direkte evalueret af CosmosID bioinformatikplatformen (som ejes og drives af CosmosID Inc. i Maryland). Dette blev udført for at udføre en undersøgelse af mikrobiomet i flere riger, profilere de gener, der er ansvarlige for antibiotikaresistens og virulens, og måle den relative overflod af forskellige organismer.

Alfa-diversitet Abundance-score-matricerne på phylum-, slægt-, art- og stammeniveauer blev brugt til at skabe alfa-diversitetsplot i CosmosID-analysen. Vegan er en R-pakke, der giver mulighed for beregning af Chao, Simpson og Shannon alpha, tre mål for mangfoldighed. Ved at bruge R-pakken udførte vi Wilcoxon Rank-Sum-tests, der sammenlignede grupperne. R-pakken blev brugt til at skabe plots med p-værdi overlejring.

Beta Diversity Principal Coordinate Analyser (PCoA) blev beregnet ved hjælp af phylum-, slægts-, art- og stammeniveaumatricer for bakterier opnået fra CosmosID for at generere beta-diversitets-PCoA'er. R's veganske pakkes funktion blev brugt til at bestemme Bray-Curtis uligheden mellem grupper, mens apes PCoA funktion blev brugt til at konstruere PCoA tabeller. Vegans adonis2-funktion blev brugt til at generere Permutationel multivariat variansanalyse (PERMANOVA) test for hver afstandsmatrix, og veganerens betadisperger-funktion blev brugt til at beregne og sammenligne beta-spredning ved hjælp af ANOVA-metoden. R-pakken blev brugt til at generere plots.

Statistisk analyse Normaliteten af ​​de kvantitative variable blev kontrolleret, før analysen blev udført. Variablernes normalitet blev kontrolleret ved at inspicere deres histogrammer, Q-Q plots og/eller vurdere deres skævhed og kurtose. For kontinuerlige variabler og endelige resultater brugte vi den uafhængige stikprøve t-test. De variable, der ikke fulgte et normalt distributionsmønster, blev evalueret ved hjælp af ikke-parametriske tests. Medianindtaget af hver type kød blev brugt til at klassificere mennesker i høj- og lavindtagskategorier, hvilket gjorde det muligt for os at isolere virkningerne af specifikke udskæringer af kød. I den ikke-overvægtige gruppe blev forbruget af hvidt kød kategoriseret som højt hvidt kød (HWM), n=32 eller lavt hvidt kød (LWM), n=16 baseret på om det var over eller under 34 gram hvidt kød pr. 1.000 kalorier. Lavvægtige individer (n=16) og højvægtsindivider (n=28) blev identificeret baseret på, hvorvidt deres indtag var på eller over det anbefalede niveau på 25 gram protein pr. 1.000 kalorier.

Den ikke-overvægtige gruppe blev yderligere opdelt i dem med et højt indtag af rødt kød (HRM), n=21 og dem med et lavt indtag af rødt kød (LRM), n=27 baseret på deres indtag af rødt kød. I den overvægtige befolkning blev højt forbrug af rødt kød defineret som (HRM, n=14) og lavt forbrug af rødt kød blev defineret som (LRM, n=30).

Kød (totalt og efter art) og tarmflora blev korreleret ved hjælp af Pearson-korrelationskoefficienten. Før der blev udført nogen parametriske test, blev hver ikke-normal variabel transformeret. Estimeret statistisk signifikans blev rapporteret ved brug af en p-værdi på 0,05 og en 95 % CI. Yderligere blev den kritiske værdi for Benjamini-Hochberg beregnet for hver korrelation ved en falsk opdagelsesrate på 0,25. International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics-versionen til Windows blev brugt til analysen (version 24; IBM Corp., New York, USA).

Denne undersøgelse brugte CosmosID-applikationen til at sammenligne tarmmikrobiotaen hos mennesker, der var overvægtige og dem, der ikke var overvægtige, såvel som dem, der var lagdelt efter deres kropsfedtprocent og talje-til-hofte-forhold, for at bestemme, om der var en sammenhæng mellem de typer og mængder af kød de spiste og deres fedme. Idet vi koncentrerede os om variation inden for en enkelt prøve, brugte vi Shannon-testen til at måle alfa-diversitet, som viser fordelingen af ​​artsoverflod i en bestemt prøve som et tal, der afhænger af artens jævnhed og rigdom. Bray-Curtis blev brugt til at analysere graden af ​​lighed eller ulighed mellem prøver for beta-diversitet.