Vliv adipozity a dalších faktorů na složení střevní mikrobioty

Materiály a metody

Studovat design

Od ledna 2019 do března 2020 byla provedena větší studie na klinice College of Applied Medical Sciences v kampusu Univerzity krále Sauda v Rijádu. Tento výzkum bude součástí této větší studie. Primárním účelem tohoto výzkumu je prozkoumat povahu spojení, které existuje mezi mikrobiotou v žaludku a markery obezity. Metodika studie je podrobně popsána jinde. Velikost vzorku 92 byla stanovena způsobem podobným předchozí studii, s hladinou významnosti nastavenou na 5 % a silou stanovenou na 80 %, na základě složení střevní mikroflóry a jejích rozdílů mezi saúdskými ženami ve vyšším vzdělání. S 95% intervalem spolehlivosti (CI) a 80% výkonem očekáváme Firmicutes: Bacteroidetes 0,9:0,4 u žen s normální hmotností a 1,7:1,7 u žen s obezitou. Lidé byli také náhodně zařazováni pomocí letáků, fakultní pomoci, prezentací a sociálních médií. Do analýzy nebyli zahrnuti účastníci s těmito vylučovacími kritérii: věk 18 let, nadváha, index tělesné hmotnosti (BMI) 25-29,9 kg/m2), těhotenství, dodržování specifické diety (např. dieta s omezeným příjmem kalorií), hlášení přítomnosti gastrointestinálních onemocnění v posledních osmi týdnech, anamnéza endokrinního nebo onkologického onemocnění, psychiatrické poruchy, anorexie, jiné zdravotní stavy nebo pomocí multivitaminů, vitaminu B.

Každý účastník dostal čas a datum, kdy měl vrátit vzorek stolice na nutriční kliniku ve stejné koleji, kde byla studie provedena, spolu s nádobou, ve které je do té doby uchovat. Účastníci poskytli vzorky krve nalačno a nechali si zaznamenat své demografické, nutriční a antropometrické informace. Finální vzorek tvořilo 92 saúdskoarabských studentek ve věku 18 až 25 let, které byly rozděleny do dvou skupin: ty s obezitou (BMI 30 kg/m2) (n=44) a ty bez (BMI=18,50- 24,99 kg/m2) (n=48). Výbor Institucionální revizní rady univerzitní nemocnice King Khalid University King Saud dal souhlas s protokolem studie (IRB # E-19-3625).

Antropometrická měření

Měření antropometrie subjektu byla provedena kvalifikovaným personálem s využitím zavedených protokolů. Stejná měření byla provedena dvakrát a výsledky z druhého záznamu byly zprůměrovány pro konečnou studii. Výška a hmotnost subjektu byly měřeny na mezinárodní standardní stupnici a dokumentovány s přesností na 0,10 kg a 0,50 cm. Hmotnost subjektu byla stanovena a zdokumentována s přesností na 0,10 kg (Digital Pearson Scale; Oxford, USA). Pro výpočet BMI jednotlivce jsme vzali jeho hmotnost v kilogramech a vydělili ji druhou mocninou jeho výšky v metrech. Výsledkem bylo BMI. Světová zdravotnická organizace (WHO) stanovila průměrnou hmotnost jako s indexem tělesné hmotnosti (BMI) mezi 18,50 a 24,99 kilogramy na metr čtvereční, zatímco obézní váha byla definována jako s BMI vyšším než 30 kilogramů na metr čtvereční.

Pás jedince byl měřen páskou, která se nenatahovala, a stejným páskem byl změřen i obvod jeho boků. Měření obvodu kyčle bylo provedeno v bodě na těle, kde byl velký trochanter největší, zatímco měření obvodu pasu bylo provedeno v bodě na těle, kde byly nejnižší žebro a pupek nejužší. Obě měření byla získána s přesností do 0,50 centimetru. Abychom vypočítali poměr pasu a boků (WHR), nejprve jsme vzali průměrný obvod pasu a vydělili jej průměrným obvodem boků. Výsledky byly poté roztříděny do následujících kategorií: i) normální WHR nižší než 0,83 a (ii) vysoký ≥0,83 WHR. Přístup bioelektrické impedanční analýzy (BIA) byl použit k získání informací o složení těla, konkrétně o procentu tělesného tuku (BF %) a svalové hmotě (770 BIA; In body, Soul, Jižní Korea). Kategorie jsou následující: (i) normální ≤ 35 %; a (ii) Vysoká >35 % BF %.

Dietní údaje

V průběhu řízeného rozhovoru shromáždili profesionální dietologové od účastníků informace o stravě. Aby bylo možné vyhodnotit příjem potravy subjektů, použila saúdská úřadem pro potraviny a léčiva ověřená verze dotazníku Food Frequency Questionnaire (FFQ). Účastníci byli dotazováni na množství jednotlivých potravin, které zkonzumovali v průběhu předchozího roku.

Analýza stolice

Bezprostředně po odběru byl každý vzorek stolice okamžitě umístěn do nádob, které nemohly unikat vzduch a měly víčka, která bezpečně seděla před zmrazením na -80 stupňů Celsia. Poté byly materiály převezeny do výzkumného zařízení, kde byly až do dalšího zkoumání uchovávány v mrazáku při teplotě -80 stupňů Celsia. Poté byl DNA Kit použit k extrakci DNA z alikvotů 0,25 g zmrazených výkalů (Katalog: 12830-50). Ke zhodnocení koncentrace extrahované DNA a také její čistoty (poměr 260 ku 280) jsme použili spektrofotometr Nano-drop (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).

Bylo stanoveno, že koncentrace DNA byla buď větší nebo rovna 1,60. Aby bylo možné zkonstruovat knihovny, každému vzorku byla nejprve přiřazena sada kombinačních duálních indexů a poté prošel celkem 12 cykly polymerázové řetězové reakce (PCR). K identifikaci celkové bakteriální DNA i DNA Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia a Fusobacteria byla použita technika metagenomového sekvenování celého genomu. Tyto informace byly poté zaslány do CosmosID ve Spojených státech, aby bylo možné určit složení střevní mikroflóry na úrovni hlavního mikrobiálního kmene.

Bioinformatické metody

Již dříve bylo popsáno, že nesmontované sekvenační čtení byly přímo vyhodnoceny bioinformatickou platformou CosmosID (kterou vlastní a provozuje společnost CosmosID Inc. v Marylandu). To bylo provedeno za účelem provedení zkoumání mikrobiomu mnoha říší, profilování genů, které jsou zodpovědné za antibiotickou rezistenci a virulenci, a měření relativního množství různých organismů.

Alfa rozmanitost Matrice skóre abundance na úrovni kmene, rodu, druhu a kmene byly použity k vytvoření grafů alfa diverzity v analýze CosmosID. Vegan je balíček R, který umožňuje vypočítat Chao, Simpson a Shannon alfa, tři míry diverzity. Pomocí balíčku R jsme provedli testy Wilcoxon Rank-Sum porovnávající skupiny. Balíček R byl použit k vytvoření grafů s překrytím p-hodnoty.

Beta Diversity Principal Coordinate Analys (PCoA) byly vypočítány pomocí kmenových, rodových, druhů a kmenových matric pro bakterie získané z CosmosID za účelem vytvoření beta diverzity PCoA. Funkce veganského balíčku R byla použita k určení Bray-Curtisovy odlišnosti mezi skupinami, zatímco funkce PCoA lidoopů byla použita ke konstrukci tabulek PCoA. Veganská funkce adonis2 byla použita ke generování testů permutační multivariační analýzy rozptylu (PERMANOVA) pro každou matici vzdálenosti a veganská funkce betadisper byla použita k výpočtu a porovnání disperze beta pomocí metody ANOVA. Ke generování grafů byl použit balíček R.

Statistická analýza Před provedením analýzy byla zkontrolována normalita kvantitativních proměnných. Normalita proměnných byla kontrolována kontrolou jejich histogramů, Q-Q grafů a/nebo hodnocením jejich šikmosti a špičatosti. Pro spojité proměnné a konečné výsledky jsme použili nezávislý výběrový t-test. Proměnné, které se neřídily vzorem normálního rozdělení, byly hodnoceny pomocí neparametrických testů. Medián příjmu každého druhu masa byl použit ke klasifikaci lidí do kategorií s vysokým a nízkým příjmem, což nám umožnilo izolovat účinky konkrétních kusů masa. Ve skupině neobézních byla spotřeba bílého masa kategorizována jako vysoká hladina bílého masa (HWM), n=32 nebo nízká hladina bílého masa (LWM), n=16 podle toho, zda byla či nebyla vyšší nebo nižší než 34 gramů bílého masa na 1000 kalorií. Jedinci s nízkou hmotností (n=16) a jedinci s vysokou hmotností (n=28) byli identifikováni na základě toho, zda jejich příjem byl či nebyl na doporučené úrovni 25 gramů bílkovin na 1000 kalorií nebo ne.

Neobézní skupina byla dále rozdělena na osoby s vysokým příjmem červeného masa (HRM), n=21 a osoby s nízkým příjmem červeného masa (LRM), n=27 na základě jejich konzumace červeného masa. U obézní populace byla vysoká spotřeba červeného masa definována jako (HRM, n=14) a nízká spotřeba červeného masa byla definována jako (LRM, n=30).

Maso (celkem a podle druhu) a střevní flóra byly korelovány pomocí Pearsonova korelačního koeficientu. Před provedením jakýchkoli parametrických testů byla každá nenormální proměnná transformována. Odhadovaná statistická významnost byla uvedena s použitím p-hodnoty 0,05 a 95% CI. Dále byla pro každou korelaci vypočtena Benjamini-Hochbergova kritická hodnota s mírou falešného objevu 0,25. Pro analýzu byla použita verze International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistics pro Windows (verze 24; IBM Corp., New York, USA).

Tato studie použila aplikaci CosmosID ke srovnání střevní mikroflóry lidí, kteří byli obézní a těch, kteří obézní nebyli, a také těch, kteří byli stratifikováni podle procenta tělesného tuku a poměru pasu k bokům, aby se zjistilo, zda existuje korelace. mezi druhy a množstvím masa, které jedli, a jejich obezitou. Zaměřili jsme se na variace v rámci jednoho vzorku, použili jsme Shannonův test k měření diverzity alfa, který zobrazuje distribuci abundance druhů v konkrétním vzorku jako číslo, které závisí na rovnoměrnosti a bohatosti druhu. Bray-Curtis byl použit k analýze stupně podobnosti nebo nepodobnosti mezi vzorky pro beta diverzitu.