質量分析イメージングによる皮膚腫瘍バイオマーカー

1. タイトル 質量分析イメージングによる皮膚腫瘍バイオマーカー

2. 目的 2.1 問題の定義 2018 年には世界中で 100 万人を超える患者が非黒色腫皮膚がん (NMSC) と診断されましたが、この種類のがんの登録不足または登録が不完全なために、この数は過小評価されている可能性があります [1]。 微視的な腫瘍をタイムリーに検出することは、がん診断において最も重要です。 私たちは、質量分析イメージング (MSI) により、一般的な皮膚がん、基底細胞がん (BCC) および扁平上皮がん (SCC) の顕微鏡的凝集体を首尾よく位置特定し、それらを隣接する正常な皮膚と生体外で区別できると考えています。 MSI は、BCC および SCC 領域 (脂質パターン) の変化した化学プロファイルを明らかにし、組織病理学的特徴の視覚的同定に依存しません。

   2.2 仮説 我々は、NMSC 細胞が、皮膚生検の切片における健康な皮膚組織とは異なる、特異的な内因性バイオマーカー (脂質パターン) を示すという仮説を立てます。 この仮説が正しければ、将来的には質量分析ガイド下手術を使用した NMSC のリアルタイム組織診断と治療を開発することが可能になります。

   2.3 結果の尺度

   • モース手術で切除された BCC および SCC 組織からの切片における、選択された脂質バイオマーカーの質量および分布の同定。
   • 日光角化症（前悪性病変）のある生検からの切片における、選択された脂質バイオマーカーの質量および分布の同定。

   2.4 背景 世界がん研究基金による 2019 年の皮膚がん報告書によると、非黒色腫皮膚がん (NMSC) の罹患率は 2018 年に 100 万人であり、世界中でより一般的に発生するがんとして分類されています [1]。 NMSC は主に基底細胞癌 (BCC) と扁平上皮癌 (SCC) を取り込みます。

   デンマークや他の西側諸国でもこれらの腫瘍の発生率は高く[2]、デンマークの発生率は増加し続けており、年間15,000人に達しています。 NMSC の主な危険因子は紫外線 (UVR) への曝露です。 明るい肌の色、明るいまたは赤い髪、明るい目の色、および免疫力が低下している人も、NMSC の原因として確立されています [1、3]。

   デンマーク人は肌が白く、地理的に移動しやすく、非常に日光を好む国民が多いため、皮膚がんの発症リスクが高くなります。 毎日、約 44 人のデンマーク人が BCC または SCC からなる NMSC 診断を受けており、40% がその後数年間で新たな腫瘍を発症します [4] NMSC は死亡率が低いですが、有病率と再発率が高いため、患者の罹患率が顕著です。 [2]、デンマークでは年間 1,900 万ユーロ以上の費用がかかり、健康管理の費用と黒色腫の医療費を上回っています [5]。 NMSC のケアは主に皮膚科医によって行われ、NMSC の治療にはモース顕微鏡手術、切除、凍結療法、さまざまな局所治療法など、複数の治療法が使用されます [2]。

   モース顕微鏡手術は再発率が最も低いため、この切除手術は高リスク NMSC の治療の第一選択となります [6]。 この顕微鏡ガイド下の手術では、訓練を受けた病理学者によって組織が切除、切片化、染色され、評価されます。 患者は手術台の上で待機し、組織の辺縁にがん細胞がないか検査されます。この発見により、治療領域からさらに組織を除去する必要があります。 したがって、モース手術は、1日に治療できる患者数が限られており、高度な訓練を受けた検査スタッフが必要であるため、時間と費用がかかります。

   何十年にもわたって、研究室は質量分析 (MS) の優れた感度と特異性の恩恵を受けてきました。 十分に確立された分析技術である MS は、化合物をイオン化し、分子量に基づいて分類します。 MS イメージング (MSI) は、同様の方法で分子の空間分布を視覚化します。 組織切片全体のスキャン (例: 皮膚）、各単位領域の質量スペクトルを生成すると、化合物の組織分布のマップが提供されます。

   MSI は、脂質、低分子タンパク質、分析対象組織内に微量濃度で分布する外因性医薬品など、多くの内因性分子種を同時に検出できます [8]。

   Janfelt ら [10] は、リン脂質の MSI を使用して表皮と真皮を区別することができました。 この技術を使用して、皮膚腫瘍には存在するが、隣接する正常な皮膚には存在しない（または異なる強度で）内因性腫瘍バイオマーカーを特定します。 悪性組織と良性組織の特異的な膜脂質サインをリアルタイムで区別する技術を使用して、MSI を NMSC の診断兵器に統合します。

   このプロジェクトを超えた長期的な目標は、悪性皮膚と健康な皮膚を区別できる脂質パターンを特定することができれば、急速蒸発イオン化質量分析法 (REIMS) (現在は iKnife として知られています) を導入することです [11]。 この方法は、労働集約的でなく時間もかからないことに加えて、単純な組織解剖学ではなく化学的な腫瘍サインを直接特定することにより、はるかに感度が高くなる可能性があります。 REIMS 技術は、質量分析計に接続された電気外科用ハンドピースで構成され、電気外科手術中に生成されるエアロゾル化組織を使用してリアルタイムの組織識別を実行できます。 組織の同定は、手術中に記録された質量スペクトルと既存の「参照ライブラリ」を自動的に照合することによって実現されます。 このモダリティは、どのような種類の組織が切除されているかに関する情報を外科医に即座に提供し、驚くべき精度でがんの縁を描写することで治療を導きます。 リピドミクスプロファイルは、組織学的腫瘍タイプ間の差異を示し、バイオマーカーとして機能することにより組織を区別することを可能にする[12]。 REIMS は、製品の信頼性と品質を確認する方法として他の分野でも有効であることが証明されています。 したがって、食品業界では REIMS を使用して牛肉と馬肉を 3 秒未満で区別し、100% の精度を誇っています [13]。

3. 方法 3.1 BCC および SCC を有する患者のための研究デザイン ビスペビャル病院皮膚科で患者がモース手術のために紹介されると、BCC または SCC が除去され、モース外科医が組織をさらに増やすかどうかを評価するために組織が埋め込まれ、切片化され、染色されます。を取り除く必要があります。 すでに除去されているこの組織の 3 つの皮膚切片 (厚さ 5 ～ 10 μm) を研究に使用します。 1 つのセクションは HE 染色されるため、対象領域がどこにあるかが正確にわかります。 MS 分析には 2 つのセクション (MSI スペクトルと REIMS スペクトル) が使用されます。

   現在、ビスペビャル病院皮膚科では高リスクBCCに対するモース手術を行っていますが、1年以内にSCCに対するモース手術も加わる予定です。

   3.2 光線性角化症患者の研究デザイン ビスペビャウ病院皮膚科で複数の光線性角化症（グレード 1、2、または 3）の治療を受けた患者が紹介された場合、状況に応じて追加のパンチ生検（2 ～ 4 mm）を行います。病変の大きさについて。 生検は包埋され、切片化されます。 3 つのスキンセクション (厚さ 5 ～ 10 um) を使用します。 1 つのセクションは HE 染色されるため、対象領域がどこにあるかが正確にわかります。 コペンハーゲン大学薬学部では 2 つのセクションが MS 分析に使用されます。 最大 100 人の患者の日光角化症を含めます。

   3.3 組織マイクロアレイ MSI の上記の切片作成により、隣接する正常組織と比較した単一の腫瘍に関する情報が得られます。 ただし、患者同士を比較する必要があるため、組織マイクロアレイを作成する必要があります。

   切除・包埋したアクチニック角化症/BCC/SCC組織から組織マイクロアレイを作製します。 1 つの切片は上記と同じ手順で MSI によって分析され、追加の切片は病理評価および Ki67 および p53 などの従来の免疫組織化学マーカーのために HE 染色されます。

4. 統計計算 Matlab または同様のプログラムを使用して、すべての質量スペクトルに対して多変量統計解析が実行されます。 線形判別分析は、前癌組織、癌組織、および正常組織間のスペクトルの違いを特定するために使用されます。 分類パフォーマンスは、1 人の患者を除外する相互検証スキームを使用して記録されます。 サンプル数は、サンプル サイズの計算と他のがんの形態に関する以前の出版物に基づいており、参照ライブラリを作成するのに十分であると推定されます。 私たちは、研究対象の一致したペアからの連続応答変数の研究を計画しています。 以前のデータは、一致したペアの応答の差が標準偏差 8 で正規分布していることを示しています。 一致するペアの平均応答の真の差が 3 である場合、この応答の差が確率 (検出力) 0,8 でゼロであるという帰無仮説を棄却するには、58 組の被験者を研究する必要があります。 この帰無仮説の検定に関連するタイプ I の誤り確率は 0.05 です。 (サンプル サイズの計算に使用されるプログラム。検出力とサンプル サイズの計算、PS、ヴァンダービルト大学、バージョン 3.1.2)。 これらの計算に基づいて、BCC、AK、および SCC の患者を 60 ～ 100 人募集します。 最小患者数は 180 人、最大患者数は 300 人です。

5. 参加者 合計で最大 300 人の患者が研究に参加するために募集されます。 包含基準および除外基準を満たす 18 歳以上の男性および女性が含まれます。 すべての潜在的な患者は、ビスペビャウ大学病院の皮膚科から募集されます。

   興味のある患者は事前情報スクリーニング訪問に招待され、そこで主治医のカタリーナ・レルシュ氏、モース病の外科医マーティン・グルード氏、プロジェクト看護師のジューン・スヴェンセン氏からこの研究に関する包括的な口頭情報が得られ、書面による情報も渡される。 安全で落ち着いた環境を確保するため、会議は別のオフィスで行われます。 患者は、希望すれば、すべての会議や介入に 1 人以上の評価者を同伴できることが特に通知されます。 書面によるインフォームドコンセントは、スクリーニング訪問後少なくとも 24 時間後に行われる外科手術当日に確保されます。

   各患者は研究者によって評価され、研究への参加の適合性が評価されます。 光学比較の均一なグループを確保するために、採用は次の基準に従って実行されます。

   5.1 参加基準 • 18 歳以上の患者。

   • AK、SCC、BCC を呈する患者。

   • 患者から得られた書面によるインフォームドコンセント。

   5.2 除外基準 • 免疫抑制患者

6. 潜在的なリスクと副作用 すべての患者には、リスクと起こり得る副作用について口頭と書面の両方で説明されます。

   6.1 パンチ生検 BCC および SCC の患者の場合、標準的なモース法によってすでに除去された組織のみを使用します。 日光角化症の患者の場合、局所麻酔下で直径 2、3、または 4 mm、深さ 3 mm の生検が採取されます。 各生検では、2 週間以内に盛り上がる直径 2 mm または 4 mm の丸い傷跡が残ります。 局所麻酔を注射すると、注射部位に痛みやチクチク感が生じる場合があります。 感染の可能性はほとんどありませんが、感染した場合には治療を行います。

7. バイオバンク 研究用バイオバンクは、委員会法第 2 条に従って設立されます。 13. 可能性のあるすべての生検/切片は、コペンハーゲン大学薬学部、Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen Ø で分析されるまで、ビスペビャウ大学病院皮膚科の施錠された -80 °C 冷凍庫に保管されます。 1 枚の MSI 画像を作成するのに最大 20 時間かかり、1 日に複数の BCC/SCC/光線性角化症の患者がいる場合は遅れが生じるため、常に 5 ～ 7 日以内に分析を実行できるわけではありません。 組織マイクロアレイを作成する場合、分析前に6～8人の患者から組織を収集します。 MSI 分析後、サンプルは破棄されます。 生検ブロックおよび組織マイクロアレイ ブロックの残りの部分の破壊は、遅くとも 1 になります。 2025 年 1 月。 非特異的な研究のために組織は保管されません。
8. 患者ジャーナルからの情報 医療従事者は、この研究に含まれる可能性のある患者をスクリーニングする際に、患者ジャーナルからの疑わしい病変の病理学的記述に関する情報を使用します。 患者がインフォームドコンセントに署名した後、腫瘍の種類、位置、大きさ、再発病変かどうかの説明に関する患者日誌からの情報が使用されます。

9. データ保護、情報保管および品質管理 9.1 品質管理 ヘルシンキ II の宣言は、優れた臨床研究の基準と同様に尊重されます。 プライバシーの尊重と患者の身体的および精神的な完全性が維持されます。 この研究は、健康研究倫理委員会およびデンマークデータ庁の保護に登録されます。

   9.2 データ保護と保管 一般データ保護規則 (デンマーク語: Databeskyttelsesloven/Personaldataforordningen) が尊重されます。 デンマーク首都地域のデータを使用した研究は公的研究とみなされます。 この研究で収集されたデータの使用と配布については、同意プロセス中に患者と話し合われます。 このプロジェクトは、データ保護コンプライアンスに関するデンマークのナレッジ センター (デンマーク語: Videncenter for Dataanmeldelse、Hovedstaden 地域) に報告されます。 名前、研究ID番号、生年月日を含むスクリーニング対象者と患者のリストが作成されます。 収集されたすべてのデータは匿名化され、個人情報の管理に関するデンマークの法律およびデンマーク保健法 (デンマーク語: Sundhedsloven) によって保護されます。 データは研究終了後、ビスペビャル病院皮膚科に登録され、5年間保管されます。

10. 財政的考慮 この研究は、主任研究者のCatharina M. Lercheによって考案されました。 営利企業による財政的支援は考えられていない。 ビスペビャウ大学病院皮膚科は、主任研究員のカタリーナ M レルチェ氏に給与を提供します。 プロジェクトに関連するその他の費用は、デンマーク癌協会 (クナイクがんミドラー 160 万 DKK) とルンドベック財団 (1000 万 DKK) によって賄われます。 主任研究者のCatharina M. Lercheと共同研究者らは、デンマーク癌協会やルンドベック財団と個人的な関係や経済的利害関係を持っていません。
11. 償還 患者に対する償還はありません。

12. 患者への情報 主任研究者であるCatharina M. Lercheは、デンマーク保健省の「Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter」に記載されているように、研究の目的、デザイン、リスクについて明確な口頭および書面による情報を提供する責任があります。デンマーク語: Sundheds- og Ældreministeriet)。 邪魔のない環境では、参加者には、/または複数の評価者を同席させる権利があること、参加者は自発的であること、研究中いつでも参加を辞退できることが認識されます。 患者には十分な検討時間が与えられます（最低 24 時間）。 患者には同意書への署名を求められます。

    患者には、研究参加者の右側にある同封資料を読むよう促されます。 参加者がインフォームドコンセントに署名するまでは、研究手順は開始されません。 患者からのその他の質問には、担当者である Catharina M. Lerche が対応します。

13. 結果の公表 陽性、陰性、決定的でない結果は公表されます。 目的は、査読済みの国際皮膚科学雑誌または皮膚科学会議で結果を発表および発表することです。 結果の知的財産権はビスペビャウ大学病院に帰属します。 出版物はバンクーバーのガイドラインに準拠します。
14. 倫理 生検はビスペビャウ大学病院の皮膚科で行われます。 個人情報およびサンプルは、個人データおよび健康法に基づいて取り扱われます。 さらに、このプロジェクトは参加者の健康と安全のリスクを最小限に抑えて実施されます。

外科手術は、世界中の病院や診療所で日常的に行われています。 NMSC バイオマーカーに関するこの研究と、質量分析に基づく皮膚がんの新しい治療法の開発には、腫瘍の再発、罹患率、およびコストを削減する可能性があります。 NMSC バイオマーカーの研究と皮膚がんの治療における REIMS の臨床導入はまだ行われていません。 この研究における有害作用の潜在的なリスクは小さく、腫瘍の再発、罹患率、コストの改善、労力と時間の削減という潜在的な利益があることが予想されます。 証拠に基づいた将来の利益の可能性と、この研究が提供する可能性のある将来の展望は、参加者が生検中に不快感を感じたり、ビスペビャウ病院への余分な訪問をしたりしないようにする必要があります。 患者の権利と補償に関するデンマークの法律が遵守されます。

15. 保険ビスペビャウ病院

16. 参考文献

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