Biomarcatori del tumore della pelle mediante imaging con spettrometria di massa

1. Titolo Biomarcatori di tumori cutanei mediante imaging mediante spettrometria di massa

2. Obiettivo 2.1 Definizione del problema Nel 2018 a più di 1 milione di pazienti è stato diagnosticato un cancro della pelle non melanoma (NMSC) in tutto il mondo e questo numero potrebbe essere sottostimato a causa della mancanza di registri o della registrazione incompleta di questo tipo di cancro [1]. Il rilevamento tempestivo dei tumori microscopici è della massima importanza nella diagnostica del cancro. Riteniamo che l'imaging mediante spettrometria di massa (MSI) possa individuare con successo gli aggregati microscopici di un comune cancro della pelle, il carcinoma basocellulare (BCC) e il carcinoma a cellule squamose (SCC), e distinguerli dalla pelle normale adiacente ex vivo. L'MSI rivela un profilo chimico alterato nella regione BCC e SCC (modelli lipidici) e non si basa sull'identificazione visiva delle caratteristiche istopatologiche.

   2.2 Ipotesi Ipotizziamo che le cellule NMSC presentino biomarcatori endogeni specifici (modelli lipidici) che differiscono dal tessuto cutaneo sano nelle sezioni delle biopsie cutanee. Se tale ipotesi sarà corretta, in futuro sarà possibile sviluppare la diagnosi tissutale in tempo reale e il trattamento dei NMSC utilizzando la chirurgia guidata dalla spettrometria di massa.

   2.3 Misure di risultato

   • Identificazione di masse e distribuzioni di biomarcatori lipidici selezionati in sezioni di tessuto BCC e SCC rimosso dalla chirurgia di Mohs.
   • Identificazione di masse e distribuzioni di biomarcatori lipidici selezionati in sezioni di biopsie con cheratosi attiniche (lesioni pre-maligne).

   2.4 Contesto Secondo lo Skin Cancer Report del 2019 del World Cancer Research Fund, nel 2018 l'incidenza del cancro della pelle non melanoma (NMSC) era di 1 milione di persone, essendo classificato come il cancro più comune a livello mondiale [1]. Le NMSC inglobano principalmente il carcinoma basocellulare (BCC) e il carcinoma a cellule squamose (SCC).

   Anche in Danimarca e in altri paesi occidentali l'incidenza di questi tumori è elevata [2] e l'incidenza danese continua ad aumentare, raggiungendo i 15.000 all'anno. Il principale fattore di rischio per le NMSC è l’esposizione alle radiazioni ultraviolette (UVR). Il colore chiaro della pelle, i capelli chiari o rossi, il colore chiaro degli occhi e le persone immunocompromesse sono altre cause accertate di NMSC [1,3].

   La popolazione danese è prevalentemente di carnagione chiara, geograficamente mobile ed estremamente amante del sole, il che aumenta il rischio di sviluppare il cancro della pelle. Ogni giorno, circa 44 danesi ricevono una diagnosi di NMSC, composta da BCC o SCC, con il 40% che sviluppa nuovi tumori negli anni successivi [4] I NMSC hanno una bassa mortalità, tuttavia hanno una notevole morbilità dei pazienti a causa della sua elevata prevalenza e recidiva [2], che costano alla Danimarca più di 19 milioni di euro all’anno, superando i costi di gestione sanitaria e i costi sanitari del melanoma [5]. La cura dei NMSC è affidata principalmente ai dermatologi e per il trattamento dei NMSC possono essere utilizzate molteplici modalità, come la chirurgia micrografica di Mohs, l'escissione, la crioterapia e diverse modalità topiche [2].

   I tassi di recidiva più bassi della chirurgia micrografica di Mohs rendono questa chirurgia escissionale la prima scelta di trattamento per i NMSC ad alto rischio [6]. Durante questo intervento chirurgico guidato dal microscopio, il tessuto viene asportato, sezionato, colorato e valutato da un patologo esperto. Il paziente attende sul tavolo operatorio mentre i margini dei tessuti vengono ispezionati per rilevare la presenza di cellule tumorali, una scoperta che richiede un'ulteriore rimozione del tessuto dall'area di trattamento. Di conseguenza, l’intervento di Mohs è lungo e costoso, a causa del numero limitato di pazienti che possono essere trattati ogni giorno e della necessità di personale di laboratorio altamente qualificato.

   Per decenni, i laboratori hanno beneficiato dell’impressionante sensibilità e specificità della spettrometria di massa (MS). Una tecnica analitica consolidata, la MS ionizza i composti e li ordina in base alla loro massa molecolare. L'imaging MS (MSI) visualizza la distribuzione spaziale delle molecole in modo simile. Scansione di intere sezioni di tessuto (ad es. pelle) e generando uno spettro di massa per ciascuna area unitaria, viene fornita una mappa della distribuzione tissutale di un composto.

   L'MSI è in grado di rilevare simultaneamente molte specie molecolari endogene, inclusi lipidi, piccole proteine ​​e farmaci esogeni distribuiti in concentrazioni minime all'interno del tessuto analizzato [8].

   Janfelt e colleghi [10] sono stati in grado di distinguere tra epidermide e derma utilizzando l'MSI sui fosfolipidi. Utilizzeremo questa tecnica per identificare biomarcatori tumorali endogeni presenti nei tumori cutanei ma non presenti (o con diversa intensità) nella pelle normale adiacente. Integrazione dell'MSI nell'arsenale diagnostico per NMSC, utilizzando la tecnologia per differenziare in tempo reale le firme lipidiche specifiche della membrana del tessuto maligno e benigno.

   L’obiettivo a lungo termine oltre questo progetto, se sarà possibile identificare modelli lipidici in grado di distinguere la pelle maligna da quella sana, è quello di introdurre la spettrometria di massa a ionizzazione e evaporazione rapida (REIMS), ora anche chiamata iKnife [11]. Questo metodo ha il potenziale per essere molto più sensibile identificando direttamente le firme chimiche del tumore piuttosto che la semplice anatomia dei tessuti, oltre ad essere meno laborioso e dispendioso in termini di tempo. La tecnica REIMS consiste in un manipolo elettrochirurgico collegato ad uno spettrometro di massa, in grado di eseguire l'identificazione dei tessuti in tempo reale utilizzando il tessuto aerosol prodotto durante l'elettrochirurgia. L'identificazione dei tessuti si ottiene confrontando automaticamente gli spettri di massa registrati durante l'intervento chirurgico con una "libreria di riferimento" preesistente. Questa modalità fornisce al chirurgo informazioni immediate sul tipo di tessuto da tagliare, guidando il trattamento delineando i margini del cancro con sorprendente precisione. I profili lipidomici hanno mostrato variazioni tra i tipi di tumore istologico, consentendo la distinzione dei tessuti agendo come biomarcatori [12]. REIMS si è dimostrato efficace anche in altri campi come modo per affermare l'autenticità e la qualità del prodotto. Pertanto, nell'industria alimentare, REIMS viene utilizzato per distinguere tra carne bovina e carne equina in <3 secondi, vantando una precisione del 100% [13].

3. Metodo 3.1 Disegno dello studio per pazienti con BCC e SCC Quando i pazienti vengono indirizzati per una procedura chirurgica di Mohs presso il Dipartimento di Dermatologia, l'Ospedale di Bispebjerg, i BCC o gli SCC vengono rimossi e il tessuto viene incorporato, sezionato e colorato affinché il chirurgo di Mohs valuti se è disponibile più tessuto è necessario rimuoverlo. Nel nostro studio verranno utilizzate tre sezioni di pelle (spesse 5-10 um) di questo tessuto già rimosso. Una sezione verrà colorata con HE in modo da sapere esattamente dove si trovano le regioni di interesse. Per l'analisi MS verranno utilizzate due sezioni (spettro MSI e spettro REIMS).

   Attualmente stiamo eseguendo la chirurgia di Mohs sui BCC ad alto rischio presso il Dipartimento di Dermatologia dell'Ospedale Bispebjerg, ma la chirurgia di Mohs dei BCC sarà inclusa entro un anno.

   3.2 Disegno dello studio per pazienti con cheratosi attiniche Quando i pazienti vengono indirizzati per una procedura per aver trattato diverse cheratosi attiniche (grado 1, 2 o 3) presso il Dipartimento di Dermatologia, Ospedale Bispebjerg, eseguiremo una biopsia extra (2-4 mm) a seconda sulla dimensione della lesione. La biopsia viene incorporata e sezionata. Utilizzeremo 3 sezioni di pelle (spessore 5-10 um). Una sezione verrà colorata con HE in modo da sapere esattamente dove si trovano le regioni di interesse. Due sezioni verranno utilizzate per l'analisi della SM presso il Dipartimento di Farmacia dell'Università di Copenaghen. Includeremo cheratosi attiniche di un massimo di 100 pazienti.

   3.3 Microarray tissutale Il suddetto sezionamento per MSI fornirà informazioni su un singolo tumore rispetto al tessuto normale adiacente. Tuttavia, dobbiamo anche confrontare i pazienti tra loro e quindi dobbiamo creare un microarray tissutale.

   Realizzeremo il microarray tissutale dal tessuto cheratosi attinica/BCC/SCC rimosso e incorporato. Una sezione verrà analizzata mediante MSI con la stessa procedura descritta sopra e le sezioni extra verranno colorate con HE per la valutazione patologica e con marcatori immunoistochimici tradizionali come Ki67 e p53.

4. Calcoli statistici L'analisi statistica multivariata sarà effettuata su tutti gli spettri di massa utilizzando Matlab o programmi simili. L'analisi discriminante lineare verrà utilizzata per identificare le differenze spettrali tra tessuto pre-maligno, cancro e normale. La prestazione della classificazione verrà registrata con uno schema di convalida incrociata "lascia un paziente fuori". Il numero di campioni si basa sul calcolo delle dimensioni del campione e su precedenti pubblicazioni su altre forme di cancro e si stima che sia sufficiente per generare una libreria di riferimento. Stiamo pianificando uno studio su una variabile di risposta continua da coppie abbinate di soggetti di studio. I dati precedenti indicano che la differenza nella risposta delle coppie abbinate è normalmente distribuita con deviazione standard 8. Se la vera differenza nella risposta media delle coppie abbinate è 3, dovremo studiare 58 coppie di soggetti per poter rifiutare l'ipotesi nulla che questa differenza di risposta sia zero con probabilità (potenza) 0,8. La probabilità di errore di tipo I associata a questo test di questa ipotesi nulla è 0,05. (programmato utilizzato per il calcolo della dimensione del campione; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versione 3.1.2). Sulla base di questi calcoli recluteremo tra 60 e 100 pazienti con BCC, AK e SCC. Il numero minimo sarà di 180 pazienti e il massimo di 300 pazienti.

5. Partecipanti In totale verranno reclutati un massimo di 300 pazienti per entrare nello studio. Sono inclusi uomini e donne di età pari o superiore a 18 anni che soddisfano i criteri di inclusione ed esclusione. Tutti i potenziali pazienti saranno reclutati dal Dipartimento di Dermatologia, Ospedale Universitario di Bispebjerg.

   I pazienti interessati saranno invitati a una visita di screening informativo preliminare durante la quale riceveranno informazioni orali complete sullo studio da parte della ricercatrice principale, Catharina Lerche, del chirurgo di Mohs Martin Gluud o dell'infermiera di progetto June Svendsen, e verranno distribuite informazioni scritte. L'incontro si svolgerà in un ufficio separato per garantire un ambiente sicuro e tranquillo. I pazienti vengono specificamente informati che, se lo desiderano, possono portare uno o più valutatori a tutti gli incontri e interventi. Il consenso informato scritto sarà garantito al momento dell'inclusione nel giorno della procedura chirurgica che avrà luogo almeno 24 ore dopo la visita di screening.

   Ciascun paziente sarà valutato dallo sperimentatore per valutare l'idoneità a partecipare allo studio. Per garantire un gruppo omogeneo di confronto ottico, il reclutamento verrà effettuato secondo i seguenti criteri:

   5.1 Criteri di inclusione • Pazienti di età superiore a 18 anni.

   • Pazienti che presentano AK, SCC e BCC.

   • Consenso informato scritto ottenuto dal paziente.

   5.2 Criteri di esclusione • Pazienti immunodepressi

6. Potenziali rischi ed effetti avversi Tutti i pazienti saranno informati sia verbalmente che per iscritto sui rischi e sui possibili effetti collaterali.

   6.1 Biopsia con punch Per i pazienti con BCC e SCC utilizzeremo solo il tessuto già rimosso mediante la procedura standard di Mohs. Per i pazienti con cheratosi attiniche, verrà ottenuta una biopsia in anestesia locale, con 2, 3 o 4 mm di diametro e 3 mm di profondità. Ogni biopsia lascerà una cicatrice rotonda di 2 mm o 4 mm di diametro che si formerà entro 2 settimane. L'iniezione di anestesia locale può causare dolore e una sensazione di formicolio/pizzicore nel sito di iniezione. C'è una possibilità minima di infezione, ma la tratteremo se si verifica.

7. Biobanca Una biobanca di ricerca sarà istituita in conformità alla legge della commissione §2 nr. 13. Tutte le potenziali biopsie/sezioni saranno conservate in un congelatore chiuso a chiave a -80 °C presso il Dipartimento di Dermatologia, Ospedale Universitario di Bispebjerg fino all'analisi presso il Dipartimento di Farmacia, Università di Copenhagen, Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen Ø. Non sempre possiamo eseguire l'analisi entro 5-7 giorni poiché occorrono fino a 20 ore per acquisire un'immagine MSI e se abbiamo diversi pazienti con BCC/SCC/cheratosi attinica in un giorno ci sarà un ritardo. Quando realizzeremo il microarray tissutale raccoglieremo i tessuti da 6-8 pazienti prima dell'analisi. Dopo l'analisi MSI i campioni verranno distrutti. La distruzione delle parti rimanenti dei blocchi bioptici e dei blocchi di microarray tissutali avverrà entro e non oltre 1. Gennaio 2025. Nessun tessuto verrà conservato per ricerche non specifiche.
8. Informazioni dai diari dei pazienti Il personale sanitario utilizzerà le informazioni riguardanti la descrizione della patologia della lesione sospetta dal diario dei pazienti durante lo screening dei possibili pazienti da includere in questo studio. Dopo che il paziente ha firmato il consenso informato, verranno utilizzate le informazioni dal diario del paziente relative alla descrizione del tipo di tumore, posizione, dimensione e se si tratta di una lesione ricorrente.

9. Protezione dei dati, archiviazione delle informazioni e controllo di qualità 9.1 Controllo di qualità La dichiarazione di Helsinki II sarà rispettata, così come gli standard di buona ricerca clinica. Verrà mantenuto il rispetto della privacy e dell’integrità fisica e mentale dei pazienti. Lo studio sarà registrato presso il Comitato per l’etica della ricerca sanitaria e l’Agenzia danese per la protezione dei dati.

   9.2 Protezione e archiviazione dei dati Sarà rispettato il Regolamento generale sulla protezione dei dati (danese: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen). La ricerca che utilizza i dati della Regione della Capitale della Danimarca è considerata ricerca pubblica. L'uso e la distribuzione dei dati raccolti in questo studio saranno discussi con i pazienti durante il processo di consenso. Il progetto sarà segnalato al Centro di conoscenza danese sulla conformità alla protezione dei dati (danese: Videncenter for Dataanmeldelse, Regione Hovedstaden). Verrà redatto un elenco degli screening e dei pazienti, inclusi nomi, numero ID dello studio e data di nascita. Tutti i dati raccolti saranno resi anonimi e protetti dalla legge danese in materia di gestione delle informazioni personali e dalla legge danese sulla salute (danese: Sundhedsloven). I dati saranno registrati e conservati per 5 anni dopo la conclusione dello studio presso il Dipartimento Dermatologico dell'Ospedale Bispebjerg.

10. Considerazioni finanziarie Lo studio è concepito dalla ricercatrice principale Catharina M. Lerche. Nessun sostegno finanziario è stato concepito dalle società commerciali. Il Dipartimento di Dermatologia dell'Ospedale Universitario di Bispebjerg fornirà lo stipendio alla ricercatrice principale Catharina M Lerche. Le altre spese relative al progetto sono coperte dalla Società danese per il cancro (Knæk Cancer midler 1,6 milioni di DKK) e dalla Fondazione Lundbeck (10 milioni di DKK). La ricercatrice principale Catharina M. Lerche e i collaboratori non hanno alcun rapporto personale o interesse economico nella Società danese contro il cancro o nella Fondazione Lundbeck.
11. Rimborsi Non è previsto alcun rimborso ai pazienti.

12. Informazioni ai pazienti La ricercatrice principale, Catharina M. Lerche, è responsabile di fornire chiare informazioni verbali e scritte sullo scopo, sulla progettazione e sui rischi dello studio, come indicato in "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" del Ministero danese della Salute ( Danese: Sundheds- og Ældreministeriet). In un ambiente indisturbato, il partecipante sarà informato del suo diritto ad avere uno/o più valutatori presenti, che il partecipante è volontario e che il ritiro è possibile in qualsiasi momento durante lo studio. Ai pazienti verrà concesso un tempo adeguato per la considerazione (minimo 24 ore). Ai pazienti verrà chiesto di firmare un modulo di consenso.

    Il paziente sarà invitato a leggere il materiale allegato alla destra del partecipante allo studio. Nessuna procedura di studio verrà avviata prima che i partecipanti abbiano firmato il consenso informato. Ulteriori domande dei pazienti verranno rivolte dalla persona di contatto Catharina M. Lerche

13. Pubblicazione dei risultati I risultati positivi, negativi e non conclusivi saranno pubblicati. L'obiettivo è pubblicare e presentare i risultati in una rivista dermatologica internazionale sottoposta a peer review e/o in occasione di conferenze dermatologiche. I diritti di proprietà intellettuale sui risultati appartengono all'Ospedale universitario di Bispebjerg. Le pubblicazioni saranno conformi alle linee guida di Vancouver.
14. Etica Le biopsie verranno effettuate presso il Dipartimento di Dermatologia, Ospedale Universitario di Bispebjerg. I dati personali e i campioni vengono trattati ai sensi della legge sui dati personali e sulla salute. Il progetto viene inoltre portato avanti con rischi minimi per la salute e la sicurezza dei partecipanti.

Le procedure chirurgiche sono eventi quotidiani negli ospedali e nelle cliniche di tutto il mondo. Questo studio sui biomarcatori NMSC e lo sviluppo di un nuovo trattamento del cancro della pelle basato sulla spettrometria di massa hanno il potenziale di ridurre la recidiva del tumore, la morbilità e i costi. Non è stato ancora effettuato uno studio sui biomarcatori NMSC e sull’implementazione clinica del REIMS nel trattamento del cancro della pelle. Si prevede che i potenziali rischi di effetti avversi in questo studio siano piccoli e che vi sia un potenziale beneficio di miglioramento della recidiva del tumore, della morbilità, dei costi, di una minore intensità di lavoro e di tempo. Il potenziale di futuri guadagni basati sull'evidenza e le prospettive future che questo studio può fornire dovrebbero essere tenuti in considerazione rispetto al disagio dei partecipanti durante la biopsia e alla visita extra all'ospedale di Bispebjerg. Verranno seguite le leggi danesi relative ai diritti e ai risarcimenti dei pazienti.

15. Assicurazione Ospedale Bispebjerg

16. Riferimenti

1. Dieta, alimentazione, attività fisica e cancro della pelle. 2018.
2. Lamberg, AL et al. Il database dermatologico danese del cancro della pelle non melanoma. Clinica. Epidemiolo. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et al. L'assunzione di alcol può modificare il rischio di cancro della pelle non melanoma: risultati di un ampio studio prospettico di coorte danese. J. Investire. Dermatolo. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. Nuovi concetti per il carcinoma basocellulare. Fattori di rischio demografici, clinici, istologici e biomarcatori. Una revisione sistematica delle prove relative al rischio di sviluppo del tumore, suscettibilità alla seconda primaria e recidiva. J. Surg. Ris. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et al. Costi della malattia per melanoma e cancro della pelle non melanoma in Danimarca. Euro. J. CancroPrec. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, NWJ et al. Chirurgia micrografica di Mohs per il trattamento del carcinoma basocellulare del volto – Risultati di uno studio retrospettivo e revisione della letteratura. Fratello J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et al. Imaging mediante spettrometria di massa nello sviluppo di farmaci. Anale. Chimica. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I. S. et al. Combinazione di MALDI-MSI e dosaggio a cassetta per la valutazione della distribuzione del farmaco nell'espianto di pelle umana. Anale. Bioanale. Chimica. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et al. Identificazione di tessuti biologici mediante spettrometria di massa a ionizzazione evaporativa rapida. Anale. Chimica. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et al. Identificazione intraoperatoria dei tessuti mediante spettrometria di massa a ionizzazione evaporativa rapida. Sci. Trad. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. et al. Identificazione delle specie di origine dei prodotti a base di carne mediante spettrometria di massa a ionizzazione evaporativa rapida. J. Agric. Chimica degli alimenti. 64, 4793-4800 (2016).