질량분석법 이미징을 통한 피부 종양 바이오마커

1. 제목 질량분석법 영상을 이용한 피부종양 바이오마커

2. 목표 2.1 문제 정의 2018년 전 세계적으로 100만 명 이상의 환자가 비흑색종 피부암(NMSC)으로 진단받았으며 이 숫자는 이러한 유형의 암에 대한 등록이 부족하거나 불완전하게 등록되어 과소평가될 수 있습니다[1]. 암 진단에서는 미세한 종양을 적시에 발견하는 것이 가장 중요합니다. 우리는 질량 분석 영상(MSI)이 일반적인 피부암, 기저 세포 암종(BCC) 및 편평 세포 암종(SCC)의 미세한 응집체를 성공적으로 찾아내고 생체 내에서 인접한 정상 피부와 구별할 수 있다고 믿습니다. MSI는 BCC 및 SCC 영역(지질 패턴)에서 변경된 화학적 프로필을 공개하며 조직병리학적 특징의 시각적 식별에 의존하지 않습니다.

   2.2 가설 우리는 NMSC 세포가 피부 생검 섹션에서 건강한 피부 조직과 다른 특정 내인성 바이오마커(지질 패턴)를 나타낸다는 가설을 세웠습니다. 만약 그 가설이 맞다면 앞으로는 질량분석법 유도 수술을 이용해 NMSC의 실시간 조직 진단과 치료를 개발하는 것이 가능할 것입니다.

   2.3 결과 측정

   • Mohs 수술에서 제거된 BCC 및 SCC 조직의 단면에서 선택된 지질 바이오마커의 질량 및 분포를 식별합니다.
   • 화학선 각화증(전악성 병변)이 있는 생검 섹션에서 선택된 지질 바이오마커의 질량 및 분포를 식별합니다.

   2.4 배경 세계암연구기금의 2019년 피부암 보고서에 따르면 비흑색종 피부암(NMSC)의 발생률은 2018년 100만 명으로 전 세계적으로 가장 흔히 발생하는 암으로 분류됩니다[1]. NMSC는 주로 기저 세포 암종(BCC)과 편평 세포 암종(SCC)을 포위합니다.

   덴마크와 기타 서구 국가에서도 이러한 종양의 발생률이 높으며[2], 덴마크 발생률은 계속 증가하여 연간 15,000명에 이릅니다. NMSC의 주요 위험 요인은 자외선(UVR)에 대한 노출입니다. 밝은 피부색, 밝은색 또는 빨간색 머리카락, 밝은 눈 색깔 및 면역 저하된 사람들은 NMSC의 다른 확립된 원인입니다[1,3].

   덴마크 인구는 대부분 피부가 희고 지리적으로 이동이 많으며 햇빛을 매우 좋아하여 피부암 발병 위험이 높습니다. 매일 ~44명의 덴마크인이 BCC 또는 SCC로 구성된 NMSC 진단을 받으며, 40%에서 다음 해에 새로운 종양이 발생합니다. [4] NMSC는 사망률이 낮지만 유병률과 재발률이 높아 환자 이환율이 주목할 만합니다. [2], 덴마크에 연간 1,900만 유로 이상의 비용이 발생하며 이는 흑색종의 건강 관리 및 건강 관리 비용을 초과합니다 [5]. NMSC 치료는 주로 피부과 전문의에 의해 이루어지며, NMSC 치료에는 Mohs 현미경 수술, 절제술, 냉동요법, 다양한 국소 요법 등 다양한 방식을 사용할 수 있습니다[2].

   Mohs 현미경 수술은 재발률이 가장 낮기 때문에 이 절제 수술은 고위험 NMSC 치료의 첫 번째 선택이 됩니다. 이 현미경 유도 수술 동안 숙련된 병리학자가 조직을 절제하고, 절개하고, 염색하고 평가합니다. 환자는 수술대에서 기다리고 있으며 조직 마진에 암세포가 있는지 검사하고 있으며, 이 발견으로 인해 치료 부위에서 조직을 추가로 제거해야 합니다. 따라서 모스 수술은 하루에 치료할 수 있는 환자 수가 제한되어 있고 고도로 훈련된 실험실 직원이 필요하기 때문에 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 듭니다.

   수십 년 동안 실험실은 질량분석법(MS)의 뛰어난 감도와 특이성의 이점을 누려왔습니다. 잘 정립된 분석 기술인 MS는 화합물을 이온화하고 분자 질량을 기준으로 분류합니다. MS 이미징(MSI)은 비슷한 방식으로 분자의 공간 분포를 시각화합니다. 전체 조직 단면 스캔(예: 피부) 각 단위 면적에 대한 질량 스펙트럼을 생성하여 화합물의 조직 분포 맵을 제공합니다.

   MSI는 지질, 작은 단백질뿐만 아니라 분석된 조직 내에 미세한 농도로 분포된 외인성 의약품을 포함하여 많은 내인성 분자종을 동시에 검출할 수 있습니다[8].

   Janfelt와 동료들은 인지질에 대한 MSI를 사용하여 표피와 진피를 구별할 수 있었습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 피부 종양에 존재하지만 인접한 정상 피부에는 존재하지 않는(또는 다른 강도로) 내인성 종양 바이오마커를 식별할 것입니다. 악성 조직과 양성 조직의 특정 막 지질 특징을 실시간으로 구별하는 기술을 사용하여 MSI를 NMSC의 진단 무기고에 통합합니다.

   이 프로젝트 이후의 장기 목표는 악성 피부와 건강한 피부를 구별할 수 있는 지질 패턴을 식별하는 것이 가능하다면 REIMS(Rapid Evaporation Ionization Mass Spectrometry, 현재 iKnife로도 사용 가능)를 도입하는 것입니다[11]. 이 방법은 단순한 조직 해부학이 아닌 화학적 종양 특징을 직접 식별함으로써 훨씬 더 민감할 뿐만 아니라 노동 집약적이고 시간 소모가 적습니다. REIMS 기술은 전기수술 중에 생성된 에어로졸화된 조직을 사용하여 실시간 조직 식별을 수행할 수 있는 질량 분석계에 연결된 전기수술 핸드피스로 구성됩니다. 조직 식별은 수술 중에 기록된 질량 스펙트럼과 기존의 "참조 라이브러리"를 자동으로 일치시켜 수행됩니다. 이 방식은 어떤 유형의 조직이 절단되는지에 대한 즉각적인 정보를 외과의사에게 제공하고, 놀라운 정밀도로 암 경계를 묘사하여 치료를 안내합니다. 지질 프로파일은 조직학적 종양 유형 간에 차이를 보여 바이오마커 역할을 하여 조직을 구별할 수 있게 했습니다[12]. REIMS는 제품의 진품성과 품질을 확인하는 방법으로 다른 분야에서도 효과적인 것으로 입증되었습니다. 따라서 식품산업에서는 REIMS를 사용하여 쇠고기와 말고기를 3초 이내에 구별하여 100%의 정확도를 자랑한다[13].

3. 방법 3.1 BCC 및 SCC 환자를 위한 연구 설계 환자가 Bispebjerg 병원 피부과에서 Mohs 수술 절차를 의뢰할 때 BCC 또는 SCC를 제거하고 Mohs 외과 의사가 더 많은 조직이 있는지 평가할 수 있도록 조직을 매립하고 절개하고 염색합니다. 제거가 필요합니다. 이미 제거된 이 조직의 3개 피부 섹션(두께 5-10um)이 우리 연구에 사용될 것입니다. 한 섹션은 HE 염색되어 관심 영역이 어디에 있는지 정확히 알 수 있습니다. MS 분석에는 두 섹션(MSI 스펙트럼 및 REIMS 스펙트럼)이 사용됩니다.

   현재 비스페브제르그병원 피부과에서 고위험 BCC에 대한 모스 수술을 진행하고 있으나, 1년 이내에 SCC에 대한 모스 수술도 포함될 예정입니다.

   3.2 광선각화증 환자를 위한 연구 설계 환자가 Bispebjerg 병원 피부과에서 여러 광선각화증(1, 2 또는 3등급)을 치료하기 위한 시술을 의뢰받은 경우, 상황에 따라 추가 펀치 생검(2-4mm)을 실시합니다. 병변의 크기에 따라. 생검은 내장되고 절단됩니다. 3개의 스킨 섹션(5-10um 두께)을 사용합니다. 한 섹션은 HE 염색되어 관심 영역이 어디에 있는지 정확히 알 수 있습니다. 코펜하겐 대학교 약학과의 MS 분석에는 두 섹션이 사용됩니다. 우리는 최대 100명의 환자로부터 얻은 광선각화증을 포함할 것입니다.

   3.3 조직 마이크로어레이 MSI에 대해 위에서 언급한 절편화는 인접한 정상 조직과 비교하여 단일 종양에 대한 지식을 제공합니다. 하지만 환자들끼리도 비교해야 하므로 조직 마이크로어레이를 만들어야 합니다.

   우리는 제거되고 내장된 악티닉 각화증/BCC/SCC 조직으로부터 조직 마이크로어레이를 만들 것입니다. 한 섹션은 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 MSI로 분석하고 추가 섹션은 Ki67 및 p53과 같은 전통적인 면역조직화학 마커 및 병리학 평가를 위해 HE 염색됩니다.

4. 통계 계산 Matlab 또는 유사한 프로그램을 사용하여 모든 질량 스펙트럼에 대해 다변량 통계 분석을 수행합니다. 선형 판별 분석을 사용하여 전암 조직, 암 조직, 정상 조직 사이의 스펙트럼 차이를 식별합니다. 분류 성능은 한 명의 환자 퇴원 교차 검증 방식으로 기록됩니다. 샘플 수는 샘플 크기 계산 및 기타 암 형태에 대한 이전 출판물을 기반으로 하며 참조 라이브러리를 생성하기에 충분한 것으로 추정됩니다. 우리는 일치하는 연구 대상 쌍의 연속 반응 변수에 대한 연구를 계획하고 있습니다. 이전 데이터에 따르면 일치하는 쌍의 반응 차이는 표준 편차 8을 사용하여 정규 분포를 따릅니다. 일치하는 쌍의 평균 응답의 실제 차이가 3인 경우 확률(검정력) 0,8에서 이 응답 차이가 0이라는 귀무 가설을 기각할 수 있도록 58쌍의 피험자를 연구해야 합니다. 이 귀무가설 검정과 관련된 제1종 오류 확률은 0.05입니다. (표본 크기 계산에 사용되도록 프로그래밍됨; 검정력 및 표본 크기 계산, PS, Vanderbilt University; 버전 3.1.2). 이러한 계산을 바탕으로 우리는 BCC, AK 및 SCC 환자 60~100명을 모집할 것입니다. 최소 180명, 최대 300명입니다.

5. 참가자 총 최대 300명의 환자가 연구에 참여하기 위해 모집됩니다. 포함 및 제외 기준을 충족하는 18세 이상의 남성과 여성이 포함됩니다. 모든 잠재적 환자는 Bispebjerg University Hospital 피부과에서 모집됩니다.

   관심 있는 환자는 예비 정보 심사 방문에 초대되어 주 연구자인 Catharina Lerche, Mohs 외과 의사 Martin Gluud 또는 프로젝트 간호사 June Svendsen으로부터 연구에 대한 포괄적인 구두 정보를 받고 서면 정보가 전달됩니다. 안전하고 차분한 환경을 보장하기 위해 회의는 별도의 사무실에서 진행될 예정입니다. 환자는 원하는 경우 모든 회의 및 중재에 한 명 이상의 평가자를 데려올 수 있다는 것을 구체적으로 안내받습니다. 스크리닝 방문 후 최소 24시간이 경과한 수술 당일 포함 시 서면 동의서를 확보합니다.

   연구자는 각 환자를 평가하여 연구 참여의 적합성을 평가할 것입니다. 동질적인 광학 비교 그룹을 보장하기 위해 다음 기준에 따라 모집이 수행됩니다.

   5.1 포함 기준 • 18세 이상의 환자.

   • AK, SCC 및 BCC를 나타내는 환자.

   • 환자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.

   5.2 제외기준 • 면역억제환자

6. 잠재적 위험 및 부작용 모든 환자에게는 위험 및 가능한 부작용에 대해 구두 및 서면 형식으로 통보됩니다.

   6.1 펀치 생검 BCC 및 SCC 환자의 경우 표준 Mohs 절차에 따라 이미 제거된 조직만 사용합니다. 광선각화증 환자의 경우 국소 마취하에 직경 2, 3 또는 4mm, 깊이 3mm의 생검을 실시합니다. 각각의 생체검사는 2주 이내에 언덕이 되는 직경 2mm 또는 4mm의 둥근 흉터를 남길 것입니다. 국소마취를 주사하면 주사 부위에 통증과 따끔거림/따끔거림이 발생할 수 있습니다. 감염 가능성은 매우 낮지만, 발생하는 경우 치료해 드립니다.

7. 바이오뱅크 연구용 바이오뱅크는 위원회 법률 §2 nr.에 따라 설립됩니다. 13. 모든 잠재적 생검/절편은 코펜하겐 대학교 약학부, Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen Ø에서 분석될 때까지 Bispebjerg University Hospital 피부과의 -80°C 잠긴 냉동고에 보관됩니다. 하나의 MSI 사진을 만드는 데 최대 20시간이 걸리고 하루에 여러 명의 BCC/SCC/광선 각화증 환자가 있는 경우 지연이 발생하기 때문에 항상 5-7일 이내에 분석을 수행할 수는 없습니다. 조직 마이크로어레이를 만들 때 분석 전에 6~8명의 환자로부터 조직을 수집합니다. MSI 분석 후 샘플은 폐기됩니다. 생검 블록 및 조직 마이크로어레이 블록의 나머지 부분은 1개 이상 파괴됩니다. 2025년 1월. 비특이적 연구를 위해 조직은 보관되지 않습니다.
8. 환자 일지의 정보 보건 담당자는 이 연구에 포함될 가능성이 있는 환자를 선별할 때 환자 일지에서 의심되는 병변의 병리학 설명에 관한 정보를 사용할 것입니다. 환자가 동의서에 서명한 후 종양 유형, 위치, 크기 및 재발 병변 여부에 대한 설명에 관한 환자 저널의 정보가 사용됩니다.

9. 데이터 보호, 정보 저장 및 품질 관리 9.1 품질 관리 헬싱키 II 선언은 우수한 임상 연구의 표준뿐만 아니라 존중됩니다. 환자의 개인 정보 보호는 물론 신체적, 정신적 완전성을 존중합니다. 이 연구는 보건 연구 윤리 위원회 및 덴마크 데이터 기관 보호에 등록됩니다.

   9.2 데이터 보호 및 저장 일반 데이터 보호 규정(덴마크어: Databeskyttetelsesloven/Persondataforordningen)이 준수됩니다. 덴마크 수도권 데이터를 활용한 연구는 공공연구로 간주됩니다. 본 연구에서 수집된 데이터의 사용 및 배포는 동의 과정에서 환자와 논의됩니다. 이 프로젝트는 데이터 보호 규정 준수에 관한 덴마크 지식 센터(덴마크어: Videncenter for Dataanmeldelse, Region Hovedstaden)에 보고됩니다. 이름, 연구 ID 번호 및 생년월일을 포함하여 선별된 환자 목록이 작성됩니다. 수집된 모든 데이터는 개인 정보 관리에 관한 덴마크 법률과 덴마크 보건법(덴마크어: Sundhedsloven)에 의해 익명화되고 보호됩니다. 데이터는 Bispebjerg 병원 피부과에 연구 종료 후 5년 동안 등록 및 저장됩니다.

10. 재정적 고려 사항 이 연구는 수석 조사관인 Catharina M. Lerche에 의해 고안되었습니다. 상업 회사에서는 어떠한 재정적 지원도 생각하지 않았습니다. Bispebjerg 대학병원 피부과에서는 수석 연구원인 Catharina M Lerche에게 급여를 제공할 예정입니다. 프로젝트와 관련된 기타 비용은 덴마크 암학회(Knæk Cancer midler 160만 DKK) 및 Lundbeck 재단(1000만 DKK)에서 부담합니다. 수석 조사관인 Catharina M. Lerche와 협력자들은 덴마크 암학회나 Lundbeck 재단과 어떠한 개인적 관계나 경제적 이해관계도 갖고 있지 않습니다.
11. 환급 환자에게는 환급이 제공되지 않습니다.

12. 환자에 대한 정보 주 조사자인 Catharina M. Lerche는 덴마크 보건부( 덴마크어: Sundheds- og Ældreministeriet). 방해받지 않는 환경에서 참가자는 한 명 이상의 평가자가 참석할 권리가 있고 해당 참가자는 자발적이며 연구 중 언제라도 철회가 가능하다는 사실을 알게 됩니다. 환자에게는 적절한 배려 시간(최소 24시간)이 제공됩니다. 환자는 동의서에 서명해야 합니다.

    환자는 연구 참가자의 오른쪽에 있는 동봉된 자료를 읽어야 합니다. 참가자가 사전 동의서에 서명하기 전에는 연구 절차가 시작되지 않습니다. 환자의 추가 질문은 담당자 Catharina M. Lerche가 처리합니다.

13. 결과 공개 긍정적, 부정적, 결론이 나지 않은 결과가 공개됩니다. 목표는 동료 심사를 거친 국제 피부과 저널 또는 피부과 컨퍼런스에서 결과를 출판하고 발표하는 것입니다. 결과에 대한 지적 재산권은 Bispebjerg University Hospital에 속합니다. 출판물은 밴쿠버 지침을 따릅니다.
14. 윤리 생체검사는 Bispebjerg 대학병원 피부과에서 실시됩니다. 개인정보 및 샘플은 개인정보 및 보건법에 따라 처리됩니다. 또한 이 프로젝트는 참가자의 건강 및 안전 위험을 최소화하면서 수행됩니다.

수술 절차는 전 세계 병원과 진료소에서 매일 일어나는 일입니다. NMSC 바이오마커에 대한 이번 연구와 질량 분석법을 기반으로 한 피부암의 새로운 치료법 개발은 종양 재발, 이환율 및 비용을 줄일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 피부암 치료에서 NMSC 바이오마커 및 REIMS의 임상적 구현에 대한 연구는 아직 수행되지 않았습니다. 본 연구에서 부작용에 대한 잠재적 위험은 적으며 종양 재발, 이환율, 비용, 노동 집약적 및 시간 소모가 적다는 개선의 잠재적 이점이 있을 것으로 예상됩니다. 이 연구가 제공할 수 있는 증거 기반 미래 이익의 잠재력과 미래 전망은 참가자의 생체 검사 및 Bispebjerg 병원 추가 방문 중 불편함을 감안하여 유지되어야 합니다. 환자의 권리와 보상에 관한 덴마크 법률을 따릅니다.

15. 보험 Bispebjerg 병원

16. 참고자료

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2. Lamberg, A. L. 외. 덴마크의 비흑색종 피부암 피부과 데이터베이스. 클린. 전염병. 8, 633-636(2016).
3. Jensen, A. et al. 알코올 섭취는 비흑색종 피부암의 위험을 변화시킬 수 있습니다: 덴마크의 대규모 전향적 코호트 연구 결과. J. 투자. 더마톨. 132, 2718-2726(2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. 기저 세포 암종에 대한 새로운 개념. 인구통계학적, 임상적, 조직학적 위험 요인 및 바이오마커. 종양 발생 위험, 2차 원발성 및 재발에 대한 민감성에 관한 증거의 체계적인 검토. J.Surg. 결의안. 159, 545-556(2010).
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12. Balog, J. et al. 급속 증발 이온화 질량 분석법을 이용한 수술 중 조직 식별. 과학. 번역. 메드. 5, (2013).

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