Skin Tumor Biomarkers af Mass Spectrometry Imaging

1. Titel Hudtumorbiomarkører ved massespektrometrisk billeddannelse

2. Mål 2.1 Problemdefinition Mere end 1 million patienter blev diagnosticeret med non-melanom hudcancer (NMSC) på verdensplan i 2018, og dette antal kan være undervurderet på grund af manglen på registre eller ufuldstændig registrering af denne type cancer [1]. Rettidig påvisning af mikroskopiske tumorer er af yderste vigtighed i cancerdiagnostik. Vi mener, at massespektrometrisk billeddannelse (MSI) med succes kan lokalisere mikroskopiske aggregater af en almindelig hudkræft, basalcellekarcinom (BCC) og pladecellekarcinom (SCC) og adskille dem fra tilstødende normal hud ex-vivo. MSI afslører en ændret kemisk profil i BCC- og SCC-regionen (lipidmønstre) og er ikke afhængig af visuel identifikation af histopatologiske træk.

   2.2 Hypotese Vi antager, at NMSC-celler udviser specifikke, endogene biomarkører (lipidmønstre), der adskiller sig fra sundt hudvæv i sektioner af hudbiopsier. Hvis denne hypotese er korrekt, vil det i fremtiden være muligt at udvikle vævsdiagnose og behandling af NMSC i realtid ved hjælp af massespektrometristyret kirurgi.

   2.3 Resultatmål

   • Identifikation af masser og fordelinger af udvalgte lipidbiomarkører i snit fra fjernet BCC- og SCC-væv fra Mohs-kirurgi.
   • Identifikation af masser og fordelinger af udvalgte lipidbiomarkører i snit fra biopsier med aktiniske keratoser (præ-maligne læsioner).

   2.4 Baggrund Forekomsten af ​​non-melanom hudkræft (NMSC) var på 1 million mennesker i 2018, ifølge Skin Cancer Report of 2019 af World Cancer Research Fund, der blev klassificeret som den mest almindeligt forekommende cancer på verdensplan [1]. NMSC omfatter primært basalcellecarcinom (BCC) og pladecellecarcinom (SCC).

   I Danmark og andre vestlige lande er forekomsten af ​​disse tumorer også høj [2], og den danske forekomst fortsætter med at stige og udgør 15.000 om året. Den vigtigste risikofaktor for NMSC er eksponering for ultraviolet stråling (UVR). Lys hudfarve, lyst eller rødt hår, lys øjenfarve og immunkompromitterede mennesker er andre etablerede årsager til NMSC [1,3].

   Den danske befolkning er overvejende lys i huden, geografisk mobil og særdeles solelskende, hvilket øger risikoen for at udvikle hudkræft. Dagligt modtager ~44 danskere en NMSC-diagnose, bestående af enten BCC eller SCC, hvor 40% udvikler nye tumorer i de følgende år [4] NMSC har en lav dødelighed, men den har en bemærkelsesværdig patientmorbiditet på grund af dens høje prævalens og recidiv [2], der koster mere end 19 millioner euro årligt til Danmark, hvilket overstiger omkostningerne til sundhedsstyring og sundhedsudgifter til melanom [5]. Behandling af NMSC er primært af dermatologer, og flere modaliteter kan bruges til behandling af NMSC, såsom Mohs mikrografisk kirurgi, excision, kryoterapi og forskellige topiske modaliteter [2].

   De laveste gentagelsesrater af Mohs mikrografisk kirurgi gør denne excisionskirurgi til det første valg af behandling for højrisiko NMSC [6]. Under denne mikroskop-guidede operation bliver væv skåret ud, sektioneret, farvet og evalueret af en uddannet patolog. Patienten venter på operationsbordet, mens vævsmarginerne inspiceres for kræftceller, et fund, der ansporer til yderligere vævsfjernelse fra behandlingsområdet. Derfor er Mohs operation tidskrævende og dyr på grund af begrænset antal patienter, der kan behandles om dagen og behov for højtuddannet laboratoriepersonale.

   I årtier har laboratorier nydt godt af den imponerende følsomhed og specificitet ved massespektrometri (MS). En veletableret analytisk teknik, MS ioniserer forbindelser og sorterer dem baseret på deres molekylære masse. MS-billeddannelse (MSI) visualiserer den rumlige fordeling af molekyler på en lignende måde. Scanning af hele vævssnit (f.eks. hud) og genererer et massespektrum for hver enhedsareal, er der tilvejebragt et kort over en forbindelses vævsfordeling.

   MSI kan detektere mange endogene molekylære arter samtidigt, inklusive lipider, små proteiner, såvel som eksogene farmaceutiske lægemidler fordelt i små koncentrationer i analyseret væv [8].

   Janfelt og kolleger [10] var i stand til at skelne mellem epidermis og dermis ved hjælp af MSI på fosfolipider. Vi vil bruge denne teknik til at identificere endogene tumorbiomarkører, der er til stede i hudtumorer, men ikke til stede (eller i forskellige intensiteter) i tilstødende normal hud. Integrering af MSI i det diagnostiske arsenal for NMSC ved at bruge teknologien til at differentiere i realtid, specifikke membranlipidsignaturer af ondartet og godartet væv.

   Det langsigtede mål ud over dette projekt, hvis det er muligt at identificere lipidmønstre, der er i stand til at skelne malign og sund hud, er at introducere Rapid Evaporation Ionization Mass Spectrometry (REIMS), også nu som iKnife [11]. Denne metode har potentialet til at være langt mere følsom ved direkte at identificere kemiske tumorsignaturer frem for simpel vævsanatomi, foruden at være mindre arbejdskrævende og tidskrævende. REIMS-teknikken består af et elektrokirurgisk håndstykke forbundet til et massespektrometer, der er i stand til at udføre vævsidentifikation i realtid ved hjælp af det aerosoliserede væv produceret under elektrokirurgi. Vævsidentifikation opnås ved automatiseret matchning af massespektre optaget under operationen med et allerede eksisterende "referencebibliotek". Modaliteten giver kirurgen øjeblikkelig information om, hvilken type væv der skæres, og vejleder behandlingen ved at afgrænse kræftmargener med forbløffende præcision. Lipidomiske profiler viste variation mellem histologiske tumortyper, hvilket muliggjorde skelnen mellem væv ved at fungere som biomarkører [12]. REIMS har også vist sig at være effektiv på andre områder som en måde at bekræfte produktets ægthed og kvalitet. I fødevareindustrien bruges REIMS således til at skelne mellem oksekød og hestekød på <3 sekunder, med en nøjagtighed på 100 % [13].

3. Metode 3.1 Studiedesign for patienter med BCC og SCC Når patienter henvises til Mohs kirurgiske indgreb på Dermatologisk afdeling, Bispebjerg Hospital, fjernes BCC eller SCC, og vævet indlejres, snittes og farves til Mohs-kirurgen for at vurdere, om mere væv skal fjernes. Tre hudsektioner (5-10 um tykke) af dette væv, der allerede er fjernet, vil blive brugt i vores undersøgelse. Den ene sektion vil blive HE-farvet, så vi ved præcis, hvor interesseområderne er. To sektioner vil blive brugt til MS-analyse (MSI-spektrum og REIMS-spektrum).

   I øjeblikket udfører vi Mohs operation af højrisiko BCC på Dermatologisk afdeling, Bispebjerg Hospital, men Mohs Operation af SCC vil blive inkluderet inden for et år.

   3.2 Studiedesign for patienter med aktiniske keratoser Når patienter henvises til et indgreb for at have behandlet flere aktiniske keratoser (grad 1, 2 eller 3) på Dermatologisk afdeling, Bispebjerg Hospital, vil vi tage en ekstra punchbiopsi (2-4 mm) på læsionens størrelse. Biopsien indlejres og sektioneres. Vi vil bruge 3 hudsektioner (5-10 um tykke). Den ene sektion vil blive HE-farvet, så vi ved præcis, hvor interesseområderne er. To sektioner vil blive brugt til MS-analyse ved Institut for Farmaci, Københavns Universitet. Vi vil inkludere aktiniske keratoser fra op til 100 patienter.

   3.3 Vævsmikroarray Ovennævnte snit for MSI vil give viden om en enkelt tumor i sammenligning med det tilstødende normale væv. Vi skal dog også sammenligne patienter med hinanden, og derfor skal vi lave et vævsmikroarray.

   Vi vil lave vævsmikroarrayet fra det fjernede og indlejrede Aktiniske keratoser/BCC/SCC-væv. En sektion vil analyseres af MSI med samme procedure som beskrevet ovenfor, og ekstra sektioner vil blive HE-farvet til patologievaluering og traditionelle immunhistokemiske markører som Ki67 og p53.

4. Statistiske beregninger Multivariat statistisk analyse vil blive udført på alle massespektre ved hjælp af Matlab eller lignende program. Lineær diskriminantanalyse vil blive brugt til at identificere spektrale forskelle mellem præ-malignt, cancer og normalt væv. Klassificeringspræstation vil blive registreret med et krydsvalideringsskema, der efterlader én patient ude. Antallet af prøver er baseret på prøvestørrelsesberegning og tidligere publikationer om andre kræftformer og estimeret til at være tilstrækkeligt til at generere et referencebibliotek. Vi planlægger en undersøgelse af en kontinuerlig responsvariabel fra matchede par af forsøgspersoner. Tidligere data indikerer, at forskellen i responsen af ​​matchede par er normalfordelt med standardafvigelse 8. Hvis den sande forskel i middelresponsen for matchede par er 3, bliver vi nødt til at studere 58 par af forsøgspersoner for at kunne afvise nulhypotesen om, at denne responsforskel er nul med sandsynlighed (potens) 0,8. Type I fejlsandsynligheden forbundet med denne test af denne nulhypotese er 0,05. (programmeret brugt til beregning af prøvestørrelse; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; version 3.1.2). Baseret på disse beregninger vil vi rekruttere mellem 60 og 100 patienter med BCC'er, AK'er og SCC'er. Minimum vil være 180 patienter og maksimum 300 patienter.

5. Deltagere I alt vil maksimalt 300 patienter blive rekrutteret til at deltage i undersøgelsen. Mænd og kvinder på 18 år eller ældre, der opfylder inklusions- og eksklusionskriterierne, er inkluderet. Alle potentielle patienter vil blive rekrutteret fra Dermatologisk afdeling, Bispebjerg Universitetshospital.

   Interesserede patienter vil blive inviteret til et foreløbigt informationsscreeningsbesøg, hvor de vil modtage omfattende mundtlig information om undersøgelsen af ​​primær investigator, Catharina Lerche, Mohs kirurg Martin Gluud eller projektsygeplejerske June Svendsen, og skriftlig information vil blive udleveret. Mødet vil finde sted på et separat kontor for at sikre et trygt og roligt miljø. Patienterne informeres specifikt om, at de kan medbringe en eller flere bedømmere til alle møder og interventioner, hvis de ønsker det. Skriftligt informeret samtykke vil blive sikret ved inklusion på operationsdagen, hvis dag vil finde sted mindst 24 timer efter screeningsbesøget.

   Hver patient vil blive evalueret af investigator for at vurdere egnetheden af ​​at deltage i undersøgelsen. For at sikre en homogen gruppe af optisk sammenligning, vil rekruttering blive udført i henhold til følgende kriterier:

   5.1 Inklusionskriterier • Patienter over 18 år.

   • Patienter med AK'er, SCC'er og BCC'er.

   • Skriftligt informeret samtykke indhentet fra patient.

   5.2 Eksklusionskriterier • Immunsupprimerede patienter

6. Potentielle risici og bivirkninger Alle patienter vil blive informeret både mundtligt og skriftligt om risici og mulige bivirkninger.

   6.1 Stempelbiopsi For patienter med BCC og SCC vil vi kun bruge væv, der allerede er fjernet ved standard Mohs-proceduren. For patienter med aktiniske keratoser vil der blive taget en biopsi under lokalbedøvelse med 2, 3 eller 4 mm i diameter og 3 mm i dybden. Hver biopsi vil efterlade et rundt ar på 2 mm eller 4 mm i diameter, der stiger inden for 2 uger. Injektion af lokalbedøvelse kan forårsage smerte og en prikkende/prikkende fornemmelse på injektionsstedet. Der er en minimal chance for infektion, men vi vil behandle det, hvis det opstår.

7. Biobank Der oprettes en forskningsbiobank i henhold til udvalgslovens §2 nr. 13. Alle potentielle biopsier/snit vil blive opbevaret i en aflåst -80 °C fryser på Hudafdelingen, Bispebjerg Universitetshospital indtil analyse på Farmaceutisk Afdeling, Københavns Universitet, Universitetsparken 2, 2100 København Ø. Vi kan ikke altid lave analysen inden for 5-7 dage, fordi det tager op til 20 timer at lave ét MSI-billede, og hvis vi har flere BCC/SCC/Actinic keratoses patienter på en dag, vil der være en forsinkelse. Når vi laver vævsmikroarrayet, samler vi væv fra 6-8 patienter før analyse. Efter MSI-analyse vil prøverne blive destrueret. Destruktion af resterende dele af biopsiblokke og vævsmikroarrayblokke vil ikke være senere end 1. januar 2025. Intet væv vil blive opbevaret til uspecifik forskning.
8. Oplysninger fra patientjournaler Sundhedspersonale vil bruge information vedrørende patologibeskrivelsen af ​​den formodede læsion fra patientjournalen ved screening af mulige patienter, der skal indgå i denne undersøgelse. Efter det informerede samtykke er underskrevet af patienten, vil information fra patientjournalen om beskrivelse af tumortype, lokalisering, størrelse og om der er tale om tilbagevendende læsion blive brugt.

9. Databeskyttelse, informationslagring og kvalitetskontrol 9.1 Kvalitetskontrol Helsinki II-erklæringen vil blive respekteret, såvel som standarderne for god klinisk forskning. Respekten for privatlivets fred samt patientens fysiske og mentale integritet vil blive opretholdt. Undersøgelsen vil blive registreret hos Den Sundhedsforskningsetiske Komité og Datastyrelsens beskyttelse.

   9.2 Databeskyttelse og opbevaring Generel databeskyttelsesforordning (Dansk: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) vil blive respekteret. Forskning ved hjælp af Region Hovedstadens data betragtes som offentlig forskning. Brug og distribution af data indsamlet i denne undersøgelse vil blive diskuteret med patienter under samtykkeprocessen. Projektet vil blive rapporteret til Videncenter for Dataanmeldelse, Region Hovedstaden. Liste over screenede og patienter, herunder navne, undersøgelses-id-nummer og fødselsdato, vil blive udarbejdet. Alle indsamlede data vil blive anonymiseret og beskyttet af dansk lovgivning vedrørende håndtering af personoplysninger og Sundhedsloven. Data vil blive registreret og opbevaret i 5 år efter studieophør på Dermatologisk Afdeling, Bispebjerg Hospital.

10. Økonomiske overvejelser Undersøgelsen er udtænkt af principinvestor Catharina M. Lerche. Ingen økonomisk støtte er blevet udtænkt af kommercielle virksomheder. Dermatologisk afdeling, Bispebjerg Universitetshospital vil yde løn til forskningsleder Catharina M Lerche. Øvrige udgifter i forbindelse med projektet dækkes af Kræftens Bekæmpelse (Knæk Cancer midler 1,6 mio. DKK) og Lundbeckfonden (10 mio. DKK). Principal investigator Catharina M. Lerche og samarbejdspartnerne har ingen personlig relation eller økonomisk interesse i Kræftens Bekæmpelse eller Lundbeckfonden.
11. Tilskud Der ydes ikke tilskud til patienterne.

12. Information til patienter Den primære investigator, Catharina M. Lerche, er ansvarlig for at give tydelige mundtlige og skriftlige oplysninger om undersøgelsens formål, design og risici, som det fremgår af "Information og samtykke til deltagelse i sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" af Sundhedsministeriet ( Dansk: Sundheds- og Ældreministeriet). I uforstyrrede omgivelser vil deltageren blive gjort opmærksom på deres ret til at have en/eller flere bedømmere til stede, at deltageren er frivillig, og at det er muligt at trække sig tilbage på ethvert tidspunkt under undersøgelsen. Patienterne vil få tilstrækkelig overvejelsestid (minimum 24 timer). Patienterne vil blive bedt om at underskrive en samtykkeerklæring.

    Patienten vil blive opfordret til at læse vedlagt materiale om studiedeltagers ret. Ingen undersøgelsesprocedurer vil blive påbegyndt, før deltagerne har underskrevet det informerede samtykke. Yderligere spørgsmål fra patienter vil blive behandlet af kontaktperson, Catharina M. Lerche

13. Offentliggørelse af resultater Positive, negative og inkonklusive resultater vil blive offentliggjort. Målet er at publicere og præsentere resultaterne i et peer-reviewet internationalt dermatologisk tidsskrift eller/og på dermatologiske konferencer. De immaterielle rettigheder til resultaterne tilhører Bispebjerg Universitetshospital. Publikationer vil være i overensstemmelse med Vancouver-retningslinjerne.
14. Etik Biopsierne vil blive taget på Dermatologisk afdeling, Bispebjerg Universitetshospital. Personoplysninger og prøver behandles efter persondata- og sundhedsloven. Projektet gennemføres desuden med minimale sundheds- og sikkerhedsrisici for deltagerne.

Kirurgiske indgreb er daglige begivenheder på hospitaler og klinikker over hele verden. Denne undersøgelse af NMSC-biomarkører og udvikling af ny behandling af hudkræft baseret på massespektrometri har potentiale til at reducere tumorgentagelse, sygelighed og omkostninger. En undersøgelse af NMSC-biomarkører og klinisk implementering af REIMS i behandlingen af ​​hudkræft er endnu ikke blevet udført. Det forventes, at de potentielle risici for uønskede virkninger i denne undersøgelse er små, og at der er en potentiel fordel ved forbedring af tumortilbagefald, morbiditet, omkostninger, mindre arbejdskrævende og tidskrævende. Potentialet for evidensbaserede fremtidige gevinster og de fremtidsperspektiver, denne undersøgelse kan give, bør holdes mod deltagernes ubehag under biopsien og ekstra besøg på Bispebjerg Hospital. Danske love vedrørende patienters rettigheder og erstatning vil blive fulgt.

15. Forsikring Bispebjerg Hospital

16. Referencer

1. Kost, ernæring, fysisk aktivitet og hudkræft. 2018.
2. Lamberg, A.L. et al. Den danske non-melanom hudkræft dermatologisk database. Clin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et al. Indtagelse af alkohol kan modificere risikoen for ikke-melanom hudkræft: Resultater af et stort dansk prospektivt kohortestudie. J. Invest. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. Nye koncepter for basalcellekarcinom. Demografiske, kliniske, histologiske risikofaktorer og biomarkører. En systematisk gennemgang af beviser vedrørende risiko for tumorudvikling, modtagelighed for anden primær og recidiv. J. Surg. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et al. Udgifter til sygdom ved melanom og ikke-melanom hudkræft i Danmark. Eur. J. Cancer Prev. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, N.W.J. et al. Mohs' mikrografiske kirurgi til behandling af basalcellekarcinom i ansigtet - Resultater af en retrospektiv undersøgelse og gennemgang af litteraturen. Br. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et al. Massespektrometrisk billeddannelse i lægemiddeludvikling. Anal. Chem. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I. S. et al. Kombination af MALDI-MSI og kassettedosis til evaluering af lægemiddeldistribution i human hudeksplantat. Anal. Bioanal. Chem. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et al. Identifikation af biologiske væv ved hurtig fordampende ioniseringsmassespektrometri. Anal. Chem. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et al. Intraoperativ vævsidentifikation ved hjælp af hurtig fordampende ioniseringsmassespektrometri. Sci. Overs. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. et al. Identifikation af oprindelsesarterne for kødprodukter ved hurtig fordampende ioniseringsmassespektrometri. J. Agric. Food Chem. 64, 4793-4800 (2016).