Biomarkery kožních nádorů pomocí zobrazování pomocí hmotnostní spektrometrie

1. Název Biomarkery kožního nádoru zobrazováním pomocí hmotnostní spektrometrie

2. Cíl 2.1 Definice problému Více než 1 milion pacientů byl celosvětově diagnostikován s nemelanomovým karcinomem kůže (NMSC) v roce 2018 a tento počet mohl být podhodnocen kvůli chybějícím registrům nebo neúplné registraci tohoto typu rakoviny [1]. Včasná detekce mikroskopických nádorů je v diagnostice rakoviny nanejvýš důležitá. Věříme, že zobrazování pomocí hmotnostní spektrometrie (MSI) může úspěšně lokalizovat mikroskopické agregáty běžné rakoviny kůže, bazaliomu (BCC) a spinocelulárního karcinomu (SCC) a odlišit je od sousední normální kůže ex-vivo. MSI odhaluje změněný chemický profil v oblasti BCC a SCC (lipidové vzorce) a nespoléhá se na vizuální identifikaci histopatologických znaků.

   2.2 Hypotéza Předpokládáme, že buňky NMSC vykazují specifické, endogenní biomarkery (lipidové vzorce), které se liší od zdravé kožní tkáně v řezech kožních biopsií. Pokud je tato hypotéza správná, bude v budoucnu možné vyvinout tkáňovou diagnostiku a léčbu NMSC v reálném čase pomocí chirurgie řízené hmotnostní spektrometrií.

   2.3 Výstupní opatření

   • Identifikace hmotností a distribuce vybraných lipidových biomarkerů v řezech z odstraněné tkáně BCC a SCC z Mohsovy operace.
   • Identifikace hmotností a distribuce vybraných lipidových biomarkerů v řezech z biopsií s aktinickými keratózami (premaligní léze).

   2.4 Pozadí Výskyt nemelanomové rakoviny kůže (NMSC) činil v roce 2018 podle zprávy o rakovině kůže z roku 2019 od World Cancer Research Fund 1 milion lidí, kteří jsou celosvětově klasifikováni jako nejčastěji se vyskytující rakovina [1]. NMSC zahrnuje primárně bazocelulární karcinom (BCC) a spinocelulární karcinom (SCC).

   V Dánsku a dalších západních zemích je výskyt těchto nádorů rovněž vysoký [2] a výskyt v Dánsku nadále roste a dosahuje 15 000 ročně. Hlavním rizikovým faktorem NMSC je expozice ultrafialovému záření (UVR). Světlá barva kůže, světlé nebo zrzavé vlasy, světlá barva očí a imunokompromitovaní lidé jsou dalšími zjištěnými příčinami NMSC [1,3].

   Dánská populace má převážně světlou pleť, je geograficky pohyblivá a mimořádně milující slunce, což zvyšuje riziko vzniku rakoviny kůže. ~44 Dánů denně obdrží diagnózu NMSC, skládající se buď z BCC, nebo SCC, přičemž u 40 % se v následujících letech vyvinou nové nádory [4] NMSC má nízkou mortalitu, má však pozoruhodnou nemocnost pacientů kvůli vysoké prevalenci a recidivám [2], což Dánsko stojí více než 19 milionů eur ročně, což převyšuje náklady na management zdraví a náklady na zdravotní péči u melanomu [5]. Péče o NMSC je primárně prováděna dermatology a při léčbě NMSC lze použít různé modality, jako je Mohsova mikrografická chirurgie, excize, kryoterapie a různé topické modality [2].

   Nejnižší míra recidivy Mohsovy mikrografické chirurgie činí z této excizní operace první volbu léčby vysoce rizikového NMSC [6]. Během tohoto mikroskopem řízeného chirurgického zákroku je tkáň vyříznuta, nařezána, obarvena a vyhodnocena vyškoleným patologem. Pacient čeká na operačním stole, zatímco jsou tkáňové okraje kontrolovány na přítomnost rakovinných buněk, což je nález, který vede k dalšímu odstranění tkáně z ošetřované oblasti. V souladu s tím je Mohsova operace časově náročná a nákladná kvůli omezenému počtu pacientů, kteří mohou být léčeni za den, a potřebují vysoce vyškolený laboratorní personál.

   Po desetiletí těžily laboratoře z působivé citlivosti a specifičnosti hmotnostní spektrometrie (MS). Dobře zavedená analytická technika, MS ionizuje sloučeniny a třídí je na základě jejich molekulové hmotnosti. MS imaging (MSI) podobným způsobem vizualizuje prostorovou distribuci molekul. Skenování celých tkáňových řezů (např. kůže) a generováním hmotnostního spektra pro každou jednotkovou oblast je poskytnuta mapa distribuce sloučeniny ve tkáni.

   MSI dokáže detekovat mnoho endogenních molekulárních druhů současně, včetně lipidů, malých proteinů a také exogenních farmaceutických léků distribuovaných v nepatrných koncentracích v analyzované tkáni [8].

   Janfelt a kolegové [10] byli schopni rozlišit mezi epidermis a dermis pomocí MSI na fosfolipidech. Tuto techniku ​​použijeme k identifikaci endogenních nádorových biomarkerů přítomných v kožních nádorech, ale nepřítomných (nebo v různé intenzitě) v přilehlé normální kůži. Integrace MSI do diagnostického arzenálu pro NMSC pomocí technologie k diferenciaci v reálném čase specifických membránových lipidových signatur maligní a benigní tkáně.

   Dlouhodobým cílem nad rámec tohoto projektu, pokud bude možné identifikovat lipidové vzorce schopné rozlišit zhoubnou a zdravou kůži, je zavést Rapid Evaporation Ionization Mass Spectrometry (REIMS), nyní také jako iKnife [11]. Tato metoda má potenciál být mnohem citlivější přímou identifikací chemických podpisů nádoru spíše než jednoduchou anatomií tkáně, navíc je méně pracná a časově náročná. Technika REIMS se skládá z elektrochirurgického násadce připojeného k hmotnostnímu spektrometru, který je schopen provádět identifikaci tkáně v reálném čase pomocí aerosolizované tkáně vytvořené během elektrochirurgie. Identifikace tkáně je dosažena automatickým porovnáváním hmotnostních spekter zaznamenaných během operace s již existující "referenční knihovnou". Tato modalita poskytuje chirurgovi okamžitou informaci o tom, jaký typ tkáně je řezán, a řídí léčbu vymezením okrajů rakoviny s ohromující přesností. Lipidomické profily ukázaly variace mezi histologickými typy nádorů, což umožnilo rozlišení tkání tím, že působily jako biomarkery [12]. REIMS se také ukázal jako účinný v jiných oblastech jako způsob potvrzení pravosti a kvality produktu. V potravinářském průmyslu se tedy REIMS používá k rozlišení hovězího a koňského masa za méně než 3 sekundy s přesností 100 % [13].

3. Metoda 3.1 Návrh studie pro pacienty s BCC a SCC Když jsou pacienti odesláni k Mohsově chirurgickému zákroku na kožním oddělení v nemocnici Bispebjerg, BCC nebo SCC jsou odstraněny a tkáň je zalita, nařezána a obarvena pro Mohsova chirurga, aby vyhodnotil, zda je více tkáně je potřeba odstranit. V naší studii budou použity tři kožní řezy (5-10 um silné) této tkáně, která je již odstraněna. Jedna sekce bude obarvena HE, takže přesně víme, kde jsou oblasti zájmu. Pro MS analýzu budou použity dvě sekce (MSI spektrum a REIMS spektrum).

   V současné době provádíme Mohsovu operaci u vysoce rizikových BCC na kožním oddělení nemocnice Bispebjerg, ale do roku bude zařazena i Mohsova operace SCC.

   3.2 Návrh studie pro pacienty s aktinickými keratózami Když jsou pacienti odesláni na proceduru s léčbou několika aktinických keratóz (1., 2. nebo 3. stupně) na kožním oddělení nemocnice Bispebjerg, provedeme extra punčovou biopsii (2-4 mm) v závislosti na na velikosti léze. Biopsie je vložena a rozdělena. Použijeme 3 řezy kůže (5-10 um silné). Jedna sekce bude obarvena HE, takže přesně víme, kde jsou oblasti zájmu. Dvě sekce budou použity pro analýzu MS na katedře farmacie Kodaňské univerzity. Zařadíme aktinické keratózy až od 100 pacientů.

   3.3 Tkáňový mikročip Výše ​​uvedený řez pro MSI poskytne znalosti o jediném nádoru ve srovnání s přilehlou normální tkání. Musíme však také porovnávat pacienty mezi sebou, a proto musíme vytvořit tkáňové mikropole.

   Z odebrané a vložené tkáně aktinických keratóz/BCC/SCC vyrobíme tkáňový mikročip. Jedna sekce bude analyzována pomocí MSI stejným postupem, jak je popsáno výše, a další sekce budou obarveny HE pro patologické hodnocení a tradiční imunohistochemické markery jako Ki67 a p53.

4. Statistické výpočty Vícerozměrná statistická analýza bude provedena na všech hmotnostních spektrech pomocí Matlabu nebo podobného programu. Lineární diskriminační analýza bude použita k identifikaci spektrálních rozdílů mezi premaligní, rakovinnou a normální tkání. Výkon klasifikace bude zaznamenán pomocí schématu křížové validace vynechání jednoho pacienta. Počet vzorků je založen na výpočtu velikosti vzorku a předchozích publikacích o jiných formách rakoviny a odhaduje se, že je dostatečný pro vytvoření referenční knihovny. Plánujeme studii spojité proměnné odezvy od spárovaných párů studovaných subjektů. Předchozí data naznačují, že rozdíl v odezvě spárovaných párů je normálně rozdělen se standardní odchylkou 8. Pokud je skutečný rozdíl v průměrné odpovědi spárovaných párů 3, budeme muset studovat 58 párů subjektů, abychom byli schopni zamítnout nulovou hypotézu, že tento rozdíl v odpovědi je nulový s pravděpodobností (mocninou) 0,8. Pravděpodobnost chyby typu I spojená s tímto testem této nulové hypotézy je 0,05. (naprogramováno pro výpočet velikosti vzorku; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; verze 3.1.2). Na základě těchto výpočtů získáme 60 až 100 pacientů s BCC, AK a SCC. Minimum bude 180 pacientů a maximum 300 pacientů.

5. Účastníci Do studie bude přijato celkem maximálně 300 pacientů. Jsou zahrnuti muži a ženy ve věku 18 let nebo starší, kteří splňují kritéria pro zařazení a vyloučení. Všichni potenciální pacienti se budou rekrutovat z Dermatologického oddělení Fakultní nemocnice Bispebjerg.

   Zainteresovaní pacienti budou pozváni na předběžnou informační screeningovou návštěvu, na které jim primární řešitel Catharina Lerche, Mohsův chirurg Martin Gluud nebo sestra projektu June Svendsen ústně dostanou vyčerpávající informace o studii, a budou jim předány písemné informace. Setkání se bude konat v samostatné kanceláři, aby bylo zajištěno bezpečné a klidné prostředí. Pacienti jsou konkrétně informováni, že mohou na všechna setkání a intervence přizvat jednoho nebo více hodnotitelů, pokud se tak rozhodnou. Písemný informovaný souhlas bude zajištěn při zařazení v den chirurgického výkonu, který proběhne minimálně 24 hodin po screeningové návštěvě.

   Každý pacient bude hodnocen zkoušejícím, aby posoudil vhodnost vstupu do studie. Aby byla zajištěna homogenní skupina optického srovnání, bude nábor prováděn podle následujících kritérií:

   5.1 Kritéria pro zařazení • Pacienti starší 18 let.

   • Pacienti s AK, SCC a BCC.

   • Písemný informovaný souhlas získaný od pacienta.

   5.2 Kritéria vyloučení • Imunosuprimovaní pacienti

6. Potenciální riziko a nežádoucí účinky Všichni pacienti budou ústně i písemně informováni o rizicích a možných vedlejších účincích.

   6.1 Punch biopsie U pacientů s BCC a SCC použijeme pouze tkáň, která je již odstraněna standardním Mohsovým postupem. U pacientů s aktinickými keratózami bude provedena biopsie v lokální anestezii o průměru 2, 3 nebo 4 mm a hloubce 3 mm. Každá biopsie zanechá kulatou jizvu o průměru 2 mm nebo 4 mm, která se během 2 týdnů zhroutí. Injekce lokální anestezie může způsobit bolest a pocit brnění/píchání v místě vpichu. Existuje minimální šance na infekci, ale pokud k ní dojde, budeme ji léčit.

7. Biobanka Výzkumná biobanka bude zřízena v souladu s výborovým zákonem §2 č. 13. Všechny potenciální biopsie/řezy budou uchovávány v uzamčeném mrazáku na -80 °C na Dermatologickém oddělení Fakultní nemocnice Bispebjerg až do analýzy na Ústavu farmacie Kodaňské univerzity, Universitetsparken 2, 2100 Kodaň Ø. Nemůžeme vždy provést analýzu během 5-7 dnů, protože vytvoření jednoho snímku MSI trvá až 20 hodin a pokud máme několik pacientů s BCC/SCC/aktinickou keratózou v jeden den, dojde ke zpoždění. Při výrobě tkáňového mikročipu shromáždíme před analýzou tkáň od 6-8 pacientů. Po analýze MSI budou vzorky zničeny. Zničení zbývajících částí bioptických bloků a bloků tkáňových mikročipů nebude kratší než 1. ledna 2025. Žádná tkáň nebude uchovávána pro nespecifický výzkum.
8. Informace z deníků pacientů Zdravotnický personál použije informace týkající se popisu patologie podezřelé léze z deníku pacienta při screeningu možných pacientů, kteří mají být zahrnuti do této studie. Po podpisu informovaného souhlasu pacientem budou použity informace z pacientského deníku týkající se popisu typu nádoru, lokalizace, velikosti a zda se jedná o recidivující lézi.

9. Ochrana dat, uchovávání informací a kontrola kvality 9.1 Kontrola kvality Bude respektována deklarace Helsinki II, stejně jako standardy dobrého klinického výzkumu. Respektování soukromí i fyzické a duševní integrity pacientů bude zachováno. Studie bude registrována u Výboru pro etiku zdravotnického výzkumu a Dánské datové agentury pro ochranu.

   9.2 Ochrana a ukládání údajů Obecné nařízení o ochraně údajů (dánsky: Databeskyttelsessloven/Persondataforordningen) bude respektováno. Výzkum využívající data Capital Region of Denmark je považován za veřejný výzkum. Použití a distribuce dat shromážděných v této studii bude prodiskutována s pacienty během procesu souhlasu. Projekt bude nahlášen dánskému znalostnímu centru o dodržování ochrany údajů (dánsky: Videncenter for Dataanmeldelse, Region Hovedstaden). Bude sestaven seznam vyšetřovaných a pacientů včetně jmen, identifikačního čísla studie a data narození. Všechny shromážděné údaje budou anonymizovány a chráněny dánským právem týkajícím se správy osobních údajů a dánským zákonem o zdraví (dánsky: Sundhedsloven). Údaje budou registrovány a uchovávány po dobu 5 let po ukončení studie na kožním oddělení nemocnice Bispebjerg.

10. Finanční úvahy Studii navrhla hlavní řešitelka Catharina M. Lerche. Žádná finanční podpora nebyla koncipována komerčními společnostmi. Dermatologické oddělení Fakultní nemocnice Bispebjerg poskytne plat hlavní řešitelce Catharině M Lerche. Ostatní výdaje spojené s projektem hradí Dánská rakovinová společnost (Knæk Cancer midler 1,6 mil. DKK) a Lundbeck Foundation (10 mil. DKK). Hlavní řešitelka Catharina M. Lerche a spolupracovníci nemají žádný osobní vztah ani ekonomický podíl v Dánské společnosti pro boj s rakovinou ani v Lundbeck Foundation.
11. Úhrady Pacientům nebudou žádné úhrady.

12. Informace pro pacienty Primární výzkumník, Catharina M. Lerche, je odpovědný za poskytování jasných slovních a písemných informací o cíli, designu a rizicích studie, jak je uvedeno v „Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter“ dánského ministerstva zdravotnictví ( dánsky: Sundheds- og Ældreministeriet). V nerušeném prostředí bude účastník informován o svém právu na přítomnost jednoho/nebo více hodnotitelů, že účastník je dobrovolný a že odstoupení je možné kdykoli během studie. Pacientům bude poskytnuta přiměřená doba na zvážení (minimálně 24 hodin). Pacienti budou požádáni, aby podepsali formulář souhlasu.

    Pacient bude vyzván, aby si přečetl přiložený materiál po právu účastníka studie. Žádné studijní postupy nebudou zahájeny, dokud účastníci nepodepíší informovaný souhlas. Další dotazy pacientů zodpoví kontaktní osoba Catharina M. Lerche

13. Zveřejnění výsledků Budou zveřejněny pozitivní, negativní a neprůkazné výsledky. Cílem je publikovat a prezentovat výsledky v recenzovaném mezinárodním dermatologickém časopise a/nebo na dermatologických konferencích. Práva duševního vlastnictví k výsledkům patří Univerzitní nemocnici Bispebjerg. Publikace budou v souladu s pokyny Vancouveru.
14. Etika Biopsie budou odebrány na kožním oddělení Fakultní nemocnice Bispebjerg. S osobními údaji a vzorky je nakládáno podle zákona o osobních údajích ao zdraví. Projekt je navíc realizován s minimálními zdravotními a bezpečnostními riziky pro účastníky.

Chirurgické zákroky jsou každodenní záležitostí v nemocnicích a klinikách po celém světě. Tato studie biomarkerů NMSC a vývoj nové léčby rakoviny kůže založené na hmotnostní spektrometrii má potenciál snížit recidivu nádoru, morbiditu a náklady. Studie biomarkerů NMSC a klinická implementace REIMS v léčbě rakoviny kůže dosud nebyla provedena. Předpokládá se, že potenciální rizika nežádoucích účinků v této studii jsou malá a že existuje potenciální přínos zlepšení recidivy nádoru, morbidity, nákladů, méně pracné a časově náročné. Potenciál budoucích zisků založených na důkazech a budoucí perspektivy, které tato studie může poskytnout, by měly být posuzovány proti nepohodlí účastníků během biopsie a další návštěvy nemocnice Bispebjerg. Budou dodržovány dánské zákony týkající se práv pacientů a odškodnění.

15. Pojištění Nemocnice Bispebjerg

16. Reference

1. Dieta, výživa, fyzická aktivita a rakovina kůže. 2018.
2. Lamberg, A. L. a kol. Dánská dermatologická databáze nemelanomové rakoviny kůže. Clin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. a kol. Pití alkoholu může změnit riziko nemelanomové rakoviny kůže: Výsledky velké dánské prospektivní kohortové studie. J. Invest. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. New Concepts for Basal Cell Carcinoma. Demografické, klinické, histologické rizikové faktory a biomarkery. Systematický přehled důkazů týkajících se rizika rozvoje nádoru, náchylnosti k druhé primární a recidivy. J. Surg. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. a kol. Náklady na onemocnění u melanomu a nemelanomové rakoviny kůže v Dánsku. Eur. J. Cancer Předchozí. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, N. W. J. a kol. Mohsova mikrografická chirurgie pro léčbu bazocelulárního karcinomu obličeje - výsledky retrospektivní studie a přehled literatury. Br. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. a kol. Hmotnostní spektrometrie při vývoji léčiv. Anální. Chem. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I. S. a kol. Kombinace MALDI-MSI a kazetového dávkování pro hodnocení distribuce léčiva v explantátu lidské kůže. Anální. Bioanal. Chem. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. a kol. Identifikace biologických tkání rychlou odpařovací ionizační hmotnostní spektrometrií. Anální. Chem. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. a kol. Intraoperační identifikace tkáně pomocí rychlé odpařovací ionizační hmotnostní spektrometrie. Sci. Přel. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. a kol. Identifikace druhů původu masných výrobků pomocí hmotnostní spektrometrie s rychlou odpařovací ionizací. J. Agric. Food Chem. 64, 4793-4800 (2016).