Biomarcadores de tumores de pele por espectrometria de massa

1. Título Biomarcadores de tumores de pele por espectrometria de massa

2. Objetivo 2.1 Definição do problema Mais de 1 milhão de pacientes foram diagnosticados com câncer de pele não melanoma (CPNM) em todo o mundo em 2018 e esse número pode estar subestimado devido à falta de registros ou registro incompleto desse tipo de câncer [1]. A detecção oportuna de tumores microscópicos é de extrema importância no diagnóstico do câncer. Acreditamos que a imagem por espectrometria de massa (MSI) pode localizar com sucesso agregados microscópicos de um câncer de pele comum, carcinoma basocelular (CBC) e carcinoma espinocelular (CEC), e distingui-los da pele normal adjacente ex-vivo. O MSI revela um perfil químico alterado na região CBC e CEC (padrões lipídicos) e não depende da identificação visual de características histopatológicas.

   2.2 Hipótese Nossa hipótese é que as células CPNM exibem biomarcadores endógenos específicos (padrões lipídicos) que diferem do tecido cutâneo saudável em seções de biópsias de pele. Se essa hipótese estiver correta, será possível no futuro desenvolver diagnóstico tecidual em tempo real e tratamento de CPNM usando cirurgia guiada por espectrometria de massa.

   2.3 Medidas de resultados

   • Identificação de massas e distribuições de biomarcadores lipídicos selecionados em cortes de tecido CBC e CEC removidos da cirurgia de Mohs.
   • Identificação de massas e distribuições de biomarcadores lipídicos selecionados em cortes de biópsias com ceratoses actínicas (lesões pré-malignas).

   2.4 Antecedentes A incidência de câncer de pele não melanoma (CPNM) foi de 1 milhão de pessoas em 2018, de acordo com o Relatório sobre Câncer de Pele de 2019 do Fundo Mundial de Pesquisa do Câncer, sendo classificado como o câncer de ocorrência mais comum em todo o mundo [1]. O CPNM abrange principalmente o carcinoma basocelular (CBC) e o carcinoma espinocelular (CEC).

   Na Dinamarca e noutros países ocidentais, a ocorrência destes tumores também é elevada [2], e a incidência dinamarquesa continua a aumentar, ascendendo a 15.000 por ano. O principal fator de risco para CPNM é a exposição à radiação ultravioleta (UVR). Pele clara, cabelos claros ou ruivos, olhos claros e pessoas imunocomprometidas são outras causas estabelecidas de CPNM [1,3].

   A população dinamarquesa é predominantemente de pele clara, geograficamente móvel e extremamente amante do sol, o que aumenta os riscos de desenvolver cancro da pele. Diariamente, cerca de 44 dinamarqueses recebem um diagnóstico de CPNM, consistindo de CBC ou CEC, com 40% desenvolvendo novos tumores nos anos seguintes [4]. O CPNM tem uma baixa mortalidade, no entanto, tem uma morbidade notável para os pacientes devido à sua alta prevalência e recorrência. [2], custando mais de 19 milhões de euros anualmente à Dinamarca, excedendo o custo da gestão da saúde e os custos dos cuidados de saúde do melanoma [5]. O cuidado do CPNM é feito principalmente por dermatologistas, e múltiplas modalidades podem ser usadas no tratamento do CPNM, como cirurgia micrográfica de Mohs, excisão, crioterapia e diferentes modalidades tópicas [2].

   As taxas de recorrência mais baixas da cirurgia micrográfica de Mohs tornam esta cirurgia excisional a primeira escolha de tratamento para CPNM de alto risco [6]. Durante esta cirurgia guiada por microscópio, o tecido é excisado, seccionado, corado e avaliado por um patologista treinado. O paciente espera na mesa de operação enquanto as margens do tecido são inspecionadas em busca de células cancerígenas, uma descoberta que estimula a remoção adicional de tecido da área de tratamento. Conseqüentemente, a cirurgia de Mohs é demorada e cara, devido ao número limitado de pacientes que podem ser tratados por dia e à necessidade de pessoal laboratorial altamente treinado.

   Durante décadas, os laboratórios beneficiaram-se da impressionante sensibilidade e especificidade da espectrometria de massa (MS). Uma técnica analítica bem estabelecida, a MS ioniza compostos e os classifica com base em sua massa molecular. A imagem MS (MSI) visualiza a distribuição espacial das moléculas de maneira semelhante. Digitalização de seções inteiras de tecido (por ex. pele) e gerando um espectro de massa para cada unidade de área, é fornecido um mapa da distribuição tecidual de um composto.

   O MSI pode detectar muitas espécies moleculares endógenas simultaneamente, incluindo lipídios, pequenas proteínas, bem como medicamentos farmacêuticos exógenos distribuídos em concentrações mínimas no tecido analisado [8].

   Janfelt e colegas [10] conseguiram distinguir entre epiderme e derme usando MSI em fosfolipídios. Usaremos esta técnica para identificar biomarcadores tumorais endógenos presentes em tumores de pele, mas não presentes (ou em diferentes intensidades) na pele normal adjacente. Integrar o MSI no arsenal diagnóstico para CPNM, usando a tecnologia para diferenciar em tempo real assinaturas lipídicas de membrana específicas de tecidos malignos e benignos.

   O objetivo de longo prazo além deste projeto, se for possível identificar padrões lipídicos capazes de distinguir pele maligna e saudável, é introduzir a Espectrometria de Massa por Ionização por Evaporação Rápida (REIMS), também agora como iKnife [11]. Este método tem o potencial de ser muito mais sensível, identificando diretamente assinaturas químicas de tumores, em vez de simples anatomia tecidual, além de ser menos trabalhoso e demorado. A técnica REIMS consiste em uma peça de mão eletrocirúrgica conectada a um espectrômetro de massas, capaz de realizar a identificação tecidual em tempo real utilizando o tecido aerossolizado produzido durante a eletrocirurgia. A identificação do tecido é obtida pela correspondência automatizada dos espectros de massa registrados durante a cirurgia, com uma “biblioteca de referência” preexistente. A modalidade fornece ao cirurgião informações imediatas sobre o tipo de tecido que está sendo cortado, orientando o tratamento ao delinear as margens do câncer com surpreendente precisão. Os perfis lipídicos mostraram variação entre os tipos histológicos de tumores, permitindo a distinção de tecidos por atuarem como biomarcadores [12]. O REIMS também se mostrou eficaz em outras áreas como forma de afirmar a autenticidade e a qualidade do produto. Assim, na indústria alimentícia, o REIMS é usado para distinguir entre carne bovina e de cavalo em <3 segundos, apresentando uma precisão de 100% [13].

3. Método 3.1 Desenho do estudo para pacientes com CBC e CEC Quando os pacientes são encaminhados para procedimento cirúrgico de Mohs no Departamento de Dermatologia do Hospital Bispebjerg, CBCs ou CECs são removidos e o tecido é incorporado, seccionado e corado para o cirurgião de Mohs avaliar se há mais tecido é necessário ser removido. Três seções de pele (5-10 um de espessura) desse tecido já removido serão utilizadas em nosso estudo. Uma seção será corada com HE para que possamos saber exatamente onde estão as regiões de interesse. Duas seções serão usadas para análise de MS (espectro MSI e espectro REIMS).

   Atualmente, estamos realizando cirurgia de Mohs em CBCs de alto risco no Departamento de Dermatologia do Hospital Bispebjerg, mas a Cirurgia de Mohs de CECs será incluída dentro de um ano.

   3.2 Desenho do estudo para pacientes com ceratoses actínicas Quando os pacientes são encaminhados para um procedimento para tratar várias ceratoses actínicas (grau 1, 2 ou 3) no Departamento de Dermatologia do Hospital Bispebjerg, faremos uma biópsia extra por punção (2-4 mm), dependendo sobre o tamanho da lesão. A biópsia é incorporada e seccionada. Usaremos 3 seções de pele (5-10 um de espessura). Uma seção será corada com HE para que possamos saber exatamente onde estão as regiões de interesse. Duas seções serão usadas para análise de MS no Departamento de Farmácia da Universidade de Copenhague. Incluiremos ceratoses actínicas de até 100 pacientes.

   3.3 Microarray tecidual O corte mencionado acima para MSI fornecerá conhecimento sobre um único tumor em comparação com o tecido normal adjacente. No entanto, também precisamos comparar os pacientes entre si e, portanto, precisamos fazer um microarranjo de tecidos.

   Faremos o microarranjo de tecido a partir do tecido de ceratoses actínicas/CBC/CEC removido e incorporado. Uma seção será analisada por MSI com o mesmo procedimento descrito acima e seções extras serão coradas com HE para avaliação patológica e marcadores imuno-histoquímicos tradicionais como Ki67 e p53.

4. Cálculos estatísticos A análise estatística multivariada será realizada em todos os espectros de massa usando Matlab ou programa similar. A análise discriminante linear será usada para identificar diferenças espectrais entre tecidos pré-malignos, cancerosos e normais. O desempenho da classificação será registrado com um esquema de validação cruzada de deixar um paciente de fora. O número de amostras é baseado no cálculo do tamanho da amostra e em publicações anteriores sobre outras formas de câncer e estimado como suficiente para gerar uma biblioteca de referência. Estamos planejando um estudo de uma variável de resposta contínua a partir de pares correspondentes de sujeitos de estudo. Dados anteriores indicam que a diferença na resposta dos pares combinados é normalmente distribuída com desvio padrão 8. Se a verdadeira diferença na resposta média dos pares combinados for 3, precisaremos estudar 58 pares de sujeitos para podermos rejeitar a hipótese nula de que esta diferença de resposta é zero com probabilidade (poder) 0,8. A probabilidade de erro Tipo I associada a este teste desta hipótese nula é de 0,05. (programado usado para cálculo de tamanho de amostra; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versão 3.1.2). Com base nesses cálculos, recrutaremos entre 60 e 100 pacientes com CBCs, CAs e CECs. O mínimo será de 180 pacientes e o máximo de 300 pacientes.

5. Participantes No total, no máximo 300 pacientes serão recrutados para entrar no estudo. Estão incluídos homens e mulheres com 18 anos ou mais que atendam aos critérios de inclusão e exclusão. Todos os pacientes potenciais serão recrutados no Departamento de Dermatologia do Hospital Universitário de Bispebjerg.

   Os pacientes interessados ​​​​serão convidados para uma visita preliminar de triagem de informações, na qual receberão informações orais abrangentes sobre o estudo pela investigadora principal, Catharina Lerche, o cirurgião de Mohs Martin Gluud ou a enfermeira do projeto June Svendsen, e as informações por escrito serão distribuídas. A reunião acontecerá em um escritório separado para garantir um ambiente seguro e tranquilo. Os pacientes são especificamente informados de que podem trazer um ou mais avaliadores para todas as reuniões e intervenções, se assim o desejarem. O consentimento informado por escrito será garantido na inclusão no dia do procedimento cirúrgico, que ocorrerá pelo menos 24 horas após a visita de triagem.

   Cada paciente será avaliado pelo investigador para avaliar a adequação de entrar no estudo. Para garantir um grupo homogêneo de comparação óptica, o recrutamento será realizado de acordo com os seguintes critérios:

   5.1 Critérios de inclusão • Pacientes acima de 18 anos.

   • Pacientes que apresentam QAs, CECs e CBCs.

   • Consentimento informado por escrito obtido do paciente.

   5.2 Critérios de exclusão • Pacientes imunossuprimidos

6. Risco potencial e efeitos adversos Todos os pacientes serão informados verbalmente e por escrito sobre os riscos e possíveis efeitos colaterais.

   6.1 Biópsia por punch Para pacientes com CBC e CEC, usaremos apenas tecido já removido pelo Procedimento de Mohs padrão. Para pacientes com ceratoses actínicas, será obtida biópsia sob anestesia local, com 2, 3 ou 4 mm de diâmetro e 3 mm de profundidade. Cada biópsia deixará uma cicatriz redonda de 2 mm ou 4 mm de diâmetro que se acumula em 2 semanas. A injeção de anestesia local pode causar dor e sensação de formigamento/formigamento no local da injeção. A chance de infecção é mínima, mas trataremos se isso ocorrer.

7. Biobanco Um biobanco de pesquisa será estabelecido de acordo com a lei do comitê §2 nr. 13. Todas as biópsias/seções potenciais serão mantidas em um freezer trancado a -80 ° C no Departamento de Dermatologia do Hospital Universitário de Bispebjerg até análise no Departamento de Farmácia da Universidade de Copenhague, Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen Ø. Nem sempre podemos fazer a análise dentro de 5-7 dias porque leva até 20 horas para fazer uma imagem MSI e se tivermos vários pacientes com CBC/CEC/queratose actínica em um dia haverá um atraso. Ao fazer o microarranjo de tecidos, coletaremos tecidos de 6 a 8 pacientes antes da análise. Após a análise do MSI, as amostras serão destruídas. A destruição das partes restantes dos blocos de biópsia e dos blocos de microarranjos de tecidos não será posterior a 1. Janeiro de 2025. Nenhum tecido será guardado para pesquisas inespecíficas.
8. Informações dos diários dos pacientes O pessoal de saúde usará informações sobre a descrição da patologia da lesão suspeita do diário do paciente ao rastrear possíveis pacientes a serem incluídos neste estudo. Após a assinatura do consentimento informado pelo paciente, serão utilizadas informações do diário do paciente sobre a descrição do tipo de tumor, localização, tamanho e se é uma lesão recorrente.

9. Protecção de dados, armazenamento de informação e controlo de qualidade 9.1 Controlo de qualidade A declaração de Helsínquia II será respeitada, bem como os padrões de boa investigação clínica. O respeito pela privacidade, bem como a integridade física e mental dos pacientes serão mantidos. O estudo será registrado no Comitê de Ética em Pesquisa em Saúde e na proteção da Agência Dinamarquesa de Dados.

   9.2 Proteção e armazenamento de dados O Regulamento Geral de Proteção de Dados (dinamarquês: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) será respeitado. A investigação que utiliza dados da Região da Capital da Dinamarca é considerada investigação pública. O uso e a distribuição dos dados coletados neste estudo serão discutidos com os pacientes durante o processo de consentimento. O projeto será reportado ao Centro Dinamarquês de Conhecimento sobre Conformidade com a Proteção de Dados (dinamarquês: Videncenter for Dataanmeldelse, Região Hovedstaden). Será elaborada uma lista de pacientes selecionados e incluídos, incluindo nomes, número de identificação do estudo e data de nascimento. Todos os dados recolhidos serão anonimizados e protegidos pela lei dinamarquesa relativa à gestão de informações pessoais e pela Lei de Saúde Dinamarquesa (dinamarquês: Sundhedsloven). Os dados serão registrados e armazenados por 5 anos após o término do estudo no Departamento Dermatológico do Hospital Bispebjerg.

10. Considerações financeiras O estudo foi concebido pela investigadora principal Catharina M. Lerche. Nenhum apoio financeiro foi concebido por empresas comerciais. O departamento de Dermatologia do Hospital Universitário de Bispebjerg fornecerá salário para a investigadora principal Catharina M Lerche. Outras despesas relacionadas com o projeto são cobertas pela Sociedade Dinamarquesa do Cancro (Knæk Cancer midler 1,6 milhões de DKK) e pela Fundação Lundbeck (10 milhões de DKK). A investigadora principal Catharina M. Lerche e os colaboradores não têm qualquer relação pessoal ou interesse económico na Sociedade Dinamarquesa do Cancro ou na Fundação Lundbeck.
11. Reembolsos Não haverá reembolso aos pacientes.

12. Informações aos pacientes A investigadora principal, Catharina M. Lerche, é responsável por fornecer informações claras, verbais e por escrito, sobre o objetivo, o desenho e os riscos do estudo, conforme declarado em "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" do Ministério da Saúde Dinamarquês ( Dinamarquês: Sundheds- og Ældreministeriet). Em um ambiente tranquilo, o participante será informado de seu direito de ter um/ou mais avaliadores presentes, que o participante é voluntário e que a retirada é possível a qualquer momento durante o estudo. Os pacientes receberão tempo de consideração adequado (mínimo 24 horas). Os pacientes serão solicitados a assinar um termo de consentimento.

    O paciente será solicitado a ler o material anexo à direita do participante do estudo. Nenhum procedimento do estudo será iniciado antes que os participantes tenham assinado o consentimento informado. Perguntas adicionais dos pacientes serão respondidas pela pessoa de contato, Catharina M. Lerche

13. Publicação dos resultados Serão publicados resultados positivos, negativos e inconclusivos. O objetivo é publicar e apresentar os resultados em uma revista internacional de dermatologia revisada por pares e/ou em conferências dermatológicas. Os direitos de propriedade intelectual dos resultados pertencem ao Hospital Universitário Bispebjerg. As publicações estarão de acordo com as diretrizes de Vancouver.
14. Ética As biópsias serão realizadas no Departamento de Dermatologia do Hospital Universitário de Bispebjerg. As informações pessoais e as amostras são tratadas de acordo com a Lei de Dados Pessoais e Saúde. Além disso, o projeto é realizado com riscos mínimos para a saúde e segurança dos participantes.

Os procedimentos cirúrgicos são eventos diários em hospitais e clínicas de todo o mundo. Este estudo de biomarcadores CPNM e o desenvolvimento de um novo tratamento para câncer de pele baseado em espectrometria de massa tem o potencial de reduzir a recorrência, morbidade e custos do tumor. Ainda não foi realizado estudo de biomarcadores CPNM e implementação clínica de REIMS no tratamento do câncer de pele. Prevê-se que os riscos potenciais de efeitos adversos neste estudo sejam pequenos e que haja um benefício potencial de melhora na recorrência do tumor, morbidade, custos, menos trabalho intensivo e demorado. O potencial de ganhos futuros baseados em evidências e as perspectivas futuras que este estudo pode fornecer devem ser considerados contra o desconforto dos participantes durante a biópsia e visita extra ao Hospital Bispebjerg. As leis dinamarquesas relativas aos direitos e indemnizações dos pacientes serão seguidas.

15. Seguros Hospital Bispebjerg

16. Referências

1. Dieta, nutrição, atividade física e câncer de pele. 2018.
2. Lamberg, A.L. et al. O banco de dados dinamarquês de dermatologia de câncer de pele não melanoma. Clin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et al. A ingestão de álcool pode modificar o risco de câncer de pele não melanoma: resultados de um grande estudo de coorte prospectivo dinamarquês. J. Investir. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. Novos conceitos para carcinoma basocelular. Fatores de risco demográficos, clínicos, histológicos e biomarcadores. Uma revisão sistemática de evidências sobre risco de desenvolvimento de tumor, suscetibilidade para segunda primária e recorrência. J. Surg. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et al. Custos da doença por melanoma e câncer de pele não melanoma na Dinamarca. EUR. J. Câncer Prev. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, NWJ et al. Cirurgia micrográfica de Mohs para tratamento do carcinoma basocelular da face - Resultados de estudo retrospectivo e revisão da literatura. Ir. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et al. Imagens de espectrometria de massa no desenvolvimento de medicamentos. Anal. Química. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I.S. et al. Combinação de MALDI-MSI e dosagem em cassete para avaliação da distribuição de medicamentos em explantes de pele humana. Anal. Bioanal. Química. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et al. Identificação de tecidos biológicos por espectrometria de massa de ionização evaporativa rápida. Anal. Química. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et al. Identificação intraoperatória de tecidos usando espectrometria de massa de ionização evaporativa rápida. Ciência. Trad. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. et al. Identificação das espécies de origem de produtos cárneos por espectrometria de massa de ionização evaporativa rápida. J. Agric. Química Alimentar. 64, 4793-4800 (2016).