Skin Tumor Biomarkers av Mass Spectrometry Imaging

1. Tittel Hudsvulstbiomarkører ved massespektrometriavbildning

2. Mål 2.1 Problemdefinisjon Mer enn 1 million pasienter ble diagnostisert med ikke-melanom hudkreft (NMSC) over hele verden i 2018 og dette tallet kan være undervurdert på grunn av mangel på registre eller ufullstendig registrering av denne typen kreft [1]. Rettidig påvisning av mikroskopiske svulster er av største betydning i kreftdiagnostikk. Vi tror at massespektrometrisk bildebehandling (MSI) kan lykkes med å lokalisere mikroskopiske aggregater av en vanlig hudkreft, basalcellekarsinom (BCC) og plateepitelkarsinom (SCC), og skille dem fra tilstøtende normal hud ex-vivo. MSI avslører en endret kjemisk profil i BCC- og SCC-regionen (lipidmønstre) og er ikke avhengig av visuell identifikasjon av histopatologiske trekk.

   2.2 Hypotese Vi antar at NMSC-celler viser spesifikke, endogene biomarkører (lipidmønstre) som skiller seg fra sunt hudvev i deler av hudbiopsier. Hvis denne hypotesen er riktig, vil det i fremtiden være mulig å utvikle sanntids vevsdiagnose og behandling av NMSC ved bruk av massespektrometri-veiledet kirurgi.

   2.3 Resultatmål

   • Identifikasjon av masser og fordelinger av utvalgte lipidbiomarkører i seksjoner fra fjernet BCC- og SCC-vev fra Mohs-kirurgi.
   • Identifikasjon av masser og fordelinger av utvalgte lipidbiomarkører i snitt fra biopsier med aktiniske keratoser (pre-maligne lesjoner).

   2.4 Bakgrunn Forekomsten av ikke-melanom hudkreft (NMSC) var på 1 million mennesker i 2018, ifølge Skin Cancer Report of 2019 av World Cancer Research Fund, og ble klassifisert som den mest vanlig forekommende kreften på verdensbasis [1]. NMSC omfatter primært basalcellekarsinom (BCC) og plateepitelkarsinom (SCC).

   I Danmark og andre vestlige land er forekomsten av disse svulstene også høy [2], og dansk forekomst fortsetter å stige, og utgjør 15.000 per år. Den viktigste risikofaktoren for NMSC er eksponering for ultrafiolett stråling (UVR). Lys hudfarge, lyst eller rødt hår, lys øyenfarge og immunkompromitterte personer er andre etablerte årsaker til NMSC [1,3].

   Den danske befolkningen er overveiende lyshudet, geografisk mobil og ekstremt solelskende, noe som øker risikoen for å utvikle hudkreft. Daglig får ~44 dansker en NMSC-diagnose, bestående av enten BCC eller SCC, med 40 % som utvikler nye svulster i de påfølgende årene [4] NMSC har lav dødelighet, men den har en bemerkelsesverdig pasientsykelighet på grunn av sin høye prevalens og residiv [2], som koster mer enn 19 millioner euro årlig til Danmark, og overstiger kostnadene for helseledelse og helsekostnader ved melanom [5]. Omsorg for NMSC er primært av hudleger, og flere modaliteter kan brukes på behandling av NMSC, slik som Mohs mikrografisk kirurgi, eksisjon, kryoterapi og forskjellige aktuelle modaliteter [2].

   De laveste residivratene av Mohs mikrografisk kirurgi gjør denne eksisjonskirurgien til det første valget av behandling for NMSC med høy risiko [6]. Under denne mikroskopstyrte operasjonen blir vev skåret ut, seksjonert, farget og evaluert av en utdannet patolog. Pasienten venter på operasjonsbordet mens vevsmarginene inspiseres for kreftceller, et funn som ber om ytterligere fjerning av vev fra behandlingsområdet. Følgelig er Mohs kirurgi tidkrevende og dyrt, på grunn av begrenset antall pasienter som kan behandles per dag og behov for høyt utdannet laboratoriepersonell.

   I flere tiår har laboratorier dratt nytte av den imponerende sensitiviteten og spesifisiteten til massespektrometri (MS). En veletablert analytisk teknikk, MS ioniserer forbindelser og sorterer dem basert på deres molekylmasse. MS imaging (MSI) visualiserer den romlige fordelingen av molekyler på en lignende måte. Skanning av hele vevssnitt (f.eks. hud) og generere et massespektrum for hver enhetsareal, er et kart over en forbindelses vevsfordeling gitt.

   MSI kan oppdage mange endogene molekylarter samtidig, inkludert lipider, små proteiner, så vel som eksogene farmasøytiske legemidler fordelt i små konsentrasjoner i analysert vev [8].

   Janfelt og medarbeidere [10] var i stand til å skille mellom epidermis og dermis ved å bruke MSI på fosfolipider. Vi vil bruke denne teknikken for å identifisere endogene tumorbiomarkører som er tilstede i hudsvulster, men ikke tilstede (eller i forskjellige intensiteter) i tilstøtende normal hud. Integrering av MSI i det diagnostiske arsenalet for NMSC, ved å bruke teknologien til å differensiere i sanntid, spesifikke membranlipidsignaturer av ondartet og godartet vev.

   Det langsiktige målet utover dette prosjektet, hvis det er mulig å identifisere lipidmønstre som er i stand til å skille mellom ondartet og sunn hud, er å introdusere Rapid Evaporation Ionization Mass Spectrometry (REIMS), også nå som iKnife [11]. Denne metoden har potensial til å være langt mer følsom ved å identifisere kjemiske tumorsignaturer direkte enn enkel vevsanatomi, i tillegg til å være mindre arbeidskrevende og tidkrevende. REIMS-teknikken består av et elektrokirurgisk håndstykke koblet til et massespektrometer, som er i stand til å utføre vevsidentifikasjon i sanntid ved å bruke det aerosoliserte vevet som produseres under elektrokirurgi. Vevsidentifikasjon oppnås ved automatisert matching av massespektre registrert under operasjonen, med et allerede eksisterende "referansebibliotek". Modaliteten gir kirurgen umiddelbar informasjon om hvilken type vev som kuttes, og veileder behandlingen ved å avgrense kreftmarginene med forbløffende presisjon. Lipidomiske profiler viste variasjon mellom histologiske tumortyper, noe som muliggjorde forskjell på vev ved å fungere som biomarkører [12]. REIMS har også vist seg å være effektiv på andre felt som en måte å bekrefte produktets autentisitet og kvalitet. I næringsmiddelindustrien brukes derfor REIMS til å skille mellom biff og hestekjøtt på <3 sekunder, med en nøyaktighet på 100 % [13].

3. Metode 3.1 Studiedesign for pasienter med BCC og SCC Når pasienter henvises til Mohs kirurgiske prosedyre ved Dermatologisk avdeling, Bispebjerg Hospital, fjernes BCC eller SCC og vevet legges inn, snittes og farges for Mohs-kirurgen for å vurdere om mer vev må fjernes. Tre hudseksjoner (5-10 um tykke) av dette vevet som allerede er fjernet, vil bli brukt i vår studie. En seksjon vil bli HE-farget slik at vi vet nøyaktig hvor interesseområdene er. To seksjoner vil bli brukt til MS-analyse (MSI-spektrum og REIMS-spektrum).

   For øyeblikket utfører vi Mohs-kirurgi på høyrisiko-BCC-er ved Dermatologisk avdeling, Bispebjerg Hospital, men Mohs-kirurgi av SCC-er vil bli inkludert innen et år.

   3.2 Studiedesign for pasienter med aktiniske keratoser Når pasienter henvises til prosedyre for å ha behandlet flere aktiniske keratoser (grad 1, 2 eller 3) ved Dermatologisk avdeling, Bispebjerg Hospital vil vi ta en ekstra punchbiopsi (2-4 mm) avhengig av på størrelsen på lesjonen. Biopsien er innebygd og seksjonert. Vi vil bruke 3 hudseksjoner (5-10 um tykke). En seksjon vil bli HE-farget slik at vi vet nøyaktig hvor interesseområdene er. To seksjoner vil bli brukt til MS-analyse ved Farmasøytisk Institutt, Københavns Universitet. Vi vil inkludere aktiniske keratoser fra opptil 100 pasienter.

   3.3 Vevsmikroarray Ovennevnte seksjonering for MSI vil gi kunnskap om en enkelt svulst sammenlignet med det tilstøtende normalvevet. Men vi må også sammenligne pasienter med hverandre, og derfor må vi lage en vevsmikroarray.

   Vi vil lage vevsmikroarrayen fra det fjernede og innebygde Aktiniske keratoser/BCC/SCC-vevet. En seksjon vil analyseres av MSI med samme prosedyre som beskrevet ovenfor, og ekstra seksjoner vil bli HE-farget for patologievaluering og tradisjonelle immunhistokjemimarkører som Ki67 og p53.

4. Statistiske beregninger Multivariat statistisk analyse vil bli utført på alle massespektre ved bruk av Matlab eller lignende program. Lineær diskriminantanalyse vil bli brukt for å identifisere spektrale forskjeller mellom pre-malignt vev, kreft og normalt vev. Klassifiseringsytelse vil bli registrert med et kryssvalideringsskjema for la-en-pasient-ut. Antall prøver er basert på prøvestørrelsesberegning og tidligere publikasjoner om andre kreftformer og estimert til å være tilstrekkelig til å generere et referansebibliotek. Vi planlegger en studie av en kontinuerlig responsvariabel fra matchede par av studieemner. Tidligere data indikerer at forskjellen i responsen til matchede par er normalfordelt med standardavvik 8. Hvis den sanne forskjellen i gjennomsnittlig respons for matchede par er 3, må vi studere 58 par med forsøkspersoner for å kunne forkaste nullhypotesen om at denne responsforskjellen er null med sannsynlighet (potens) 0,8. Type I feilsannsynligheten knyttet til denne testen av denne nullhypotesen er 0,05. (programmert brukt for beregning av utvalgsstørrelse; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versjon 3.1.2). Basert på disse beregningene vil vi rekruttere mellom 60 og 100 pasienter med BCC, AK og SCC. Minimum vil være 180 pasienter og maksimum 300 pasienter.

5. Deltakere Totalt vil maksimalt 300 pasienter bli rekruttert til å delta i studien. Menn og kvinner i alderen 18 år eller eldre som oppfyller inkluderings- og eksklusjonskriteriene er inkludert. Alle potensielle pasienter vil bli rekruttert fra Dermatologisk avdeling, Bispebjerg Universitetssykehus.

   Interesserte pasienter vil bli invitert til et foreløpig informasjonsscreeningbesøk hvor de vil motta omfattende muntlig informasjon om studien av primæretterforsker, Catharina Lerche, Mohs kirurg Martin Gluud eller prosjektsykepleier June Svendsen, og skriftlig informasjon vil bli delt ut. Møtet vil foregå på eget kontor for å sikre trygge og rolige omgivelser. Pasientene er spesielt informert om at de kan ta med en eller flere bedømmere til alle møter og intervensjoner dersom de ønsker det. Skriftlig informert samtykke vil bli sikret ved inkludering på den kirurgiske prosedyredagen som vil finne sted minst 24 timer etter screeningbesøket.

   Hver pasient vil bli evaluert av etterforskeren for å vurdere egnetheten til å delta i studien. For å sikre en homogen gruppe av optisk sammenligning, vil rekruttering utføres i henhold til følgende kriterier:

   5.1 Inklusjonskriterier • Pasienter over 18 år.

   • Pasienter med AK, SCC og BCC.

   • Skriftlig informert samtykke innhentet fra pasient.

   5.2 Eksklusjonskriterier • Immunsupprimerte pasienter

6. Potensiell risiko og bivirkninger Alle pasienter vil bli informert både muntlig og skriftlig om risiko og mulige bivirkninger.

   6.1 Punchbiopsi For pasienter med BCC og SCC vil vi kun bruke vev som allerede er fjernet etter standard Mohs-prosedyre. For pasienter med aktiniske keratoser vil det bli tatt en biopsi under lokalbedøvelse, med 2, 3 eller 4 mm i diameter og 3 mm i dybden. Hver biopsi vil etterlate et rundt arr på 2 mm eller 4 mm i diameter som hever seg innen 2 uker. Injeksjon av lokalbedøvelse kan forårsake smerte og en prikkende/prikkende følelse på injeksjonsstedet. Det er en minimal sjanse for infeksjon, men vi vil behandle det hvis det oppstår.

7. Biobank Det skal opprettes en forskningsbiobank i henhold til komitéloven §2 nr. 1. 3. Alle potensielle biopsier/snitt vil bli oppbevart i en låst -80 °C fryser ved Dermatologisk avdeling, Bispebjerg Universitetssykehus frem til analyse ved Farmasøytisk Institutt, Københavns Universitet, Universitetsparken 2, 2100 København Ø. Vi kan ikke alltid gjøre analysen innen 5-7 dager fordi det tar opptil 20 timer å lage ett MSI-bilde, og hvis vi har flere BCC/SCC/Actinic keratosespasienter på en dag vil det oppstå en forsinkelse. Når vi lager vevsmikroarrayet vil vi samle vev fra 6-8 pasienter før analyse. Etter MSI-analyse vil prøvene bli ødelagt. Ødeleggelse av gjenværende deler av biopsiblokker og vevsmikroarrayblokker vil ikke være senere enn 1. januar 2025. Ingen vev vil bli oppbevart for uspesifikk forskning.
8. Informasjon fra pasientjournal Helsepersonell vil bruke informasjon vedrørende patologibeskrivelsen av mistenkt lesjon fra pasientjournalen ved screening av mulige pasienter som skal inkluderes i denne studien. Etter at informert samtykke er signert av pasienten, vil informasjon fra pasientjournal om beskrivelse av tumortype, lokalisering, størrelse og om det er tilbakevendende lesjon benyttes.

9. Databeskyttelse, informasjonslagring og kvalitetskontroll 9.1 Kvalitetskontroll Helsinki II-erklæringen vil bli respektert, så vel som standardene for god klinisk forskning. Respekten for personvernet samt pasientens fysiske og mentale integritet skal opprettholdes. Studien vil bli registrert hos Komiteen for helseforskningsetisk og datatilsynets beskyttelse.

   9.2 Databeskyttelse og lagring Generell databeskyttelsesforordning (dansk: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) vil bli respektert. Forskning som bruker Region Hovedstadens data regnes som offentlig forskning. Bruk og distribusjon av data samlet inn i denne studien vil bli diskutert med pasienter under samtykkeprosessen. Prosjektet vil bli rapportert til Dansk Knowledge Centre on Data Protection Compliance (dansk: Videncenter for Dataanmeldelse, Region Hovedstaden). Liste over screenede og pasienter, inkludert navn, studie-ID-nummer og fødselsdato vil bli utarbeidet. Alle data som samles inn vil bli anonymisert og beskyttet av dansk lov om håndtering av personopplysninger og den danske helseloven (dansk: Sundhedsloven). Data vil bli registrert og lagret i 5 år etter studieavslutning ved hudavdelingen, Bispebjerg Hospital.

10. Økonomiske vurderinger Studien er unnfanget av hovedetterforsker Catharina M. Lerche. Ingen økonomisk støtte har blitt unnfanget av kommersielle selskaper. Dermatologisk avdeling, Bispebjerg Universitetssykehus vil gi lønn til hovedetterforsker Catharina M Lerche. Andre utgifter knyttet til prosjektet dekkes av Kreftforeningen (Knæk Cancer midler 1,6 mill DKK) og Lundbeck Foundation (10 mill DKK). Hovedetterforsker Catharina M. Lerche og samarbeidspartnerne har ingen personlig relasjon eller økonomisk eierandel i Kreftforeningen eller Lundbeckfondet.
11. Refusjoner Det vil ikke gis refusjoner til pasientene.

12. Informasjon til pasienter Primæretterforskeren, Catharina M. Lerche, er ansvarlig for å gi tydelig verbal og skriftlig informasjon om studiens mål, design og risiko, slik det står i "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" av Danish Health Ministry ( Dansk: Sundheds- og Ældreministeriet). I en uforstyrret setting vil deltakeren bli gjort oppmerksom på sin rett til å ha en/eller flere bedømmere til stede, at deltakeren er frivillig, og at tilbaketrekking er mulig når som helst i løpet av studien. Pasienter vil få tilstrekkelig overveielsestid (minimum 24 timer). Pasienter vil bli bedt om å signere et samtykkeskjema.

    Pasienten vil bli oppfordret til å lese vedlagt materiale om studiedeltakers rettighet. Ingen studieprosedyrer vil bli startet før deltakerne har signert det informerte samtykket. Ytterligere spørsmål fra pasienter vil bli tatt opp av kontaktperson, Catharina M. Lerche

13. Publisering av resultater Positive, negative og usikre resultater vil bli publisert. Målet er å publisere og presentere resultatene i et fagfellevurdert internasjonalt dermatologisk tidsskrift eller/og på dermatologiske konferanser. De immaterielle rettighetene til resultatene tilhører Bispebjerg Universitetssykehus. Publikasjoner vil være i samsvar med Vancouver-retningslinjene.
14. Etikk Biopsiene vil bli tatt ved Dermatologisk avdeling, Bispebjerg Universitetssykehus. Personopplysninger og prøver behandles etter personopplysnings- og helseloven. Prosjektet gjennomføres videre med minimal helse- og sikkerhetsrisiko for deltakerne.

Kirurgiske prosedyrer er daglige hendelser på sykehus og klinikker over hele verden. Denne studien av NMSC-biomarkører og utvikling av ny behandling av hudkreft basert på massespektrometri har potensial til å redusere tumorresidiv, sykelighet og kostnader. En studie av NMSC-biomarkører og klinisk implementering av REIMS i behandling av hudkreft er ennå ikke utført. Det forventes at den potensielle risikoen for uønskede effekter i denne studien er liten og at det er en potensiell fordel med forbedring av tumorresidiv, sykelighet, kostnader, mindre arbeidskrevende og tidkrevende. Potensialet til evidensbaserte fremtidige gevinster og fremtidsperspektivene denne studien kan gi, bør holdes mot deltakernes ubehag under biopsien og ekstra besøk til Bispebjerg Hospital. Danske lover angående pasientrettigheter og kompensasjon vil bli fulgt.

15. Forsikring Bispebjerg Hospital

16. Referanser

1. Kosthold, ernæring, fysisk aktivitet og hudkreft. 2018.
2. Lamberg, A.L. et al. Den danske dermatologiske databasen for ikke-melanom hudkreft. Clin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et al. Inntak av alkohol kan endre risikoen for ikke-melanom hudkreft: Resultater av en stor dansk prospektiv kohortstudie. J. Invest. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. Nye konsepter for basalcellekarsinom. Demografiske, kliniske, histologiske risikofaktorer og biomarkører. En systematisk gjennomgang av bevis vedrørende risiko for svulstutvikling, mottakelighet for andre primære og residiv. J. Surg. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et al. Sykdomskostnader for melanom og ikke-melanom hudkreft i Danmark. Eur. J. Cancer Prev. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, N.W.J. et al. Mohs' mikrografisk kirurgi for behandling av basalcellekarsinom i ansiktet - Resultater av en retrospektiv studie og gjennomgang av litteraturen. Br. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et al. Massespektrometri avbildning i medikamentutvikling. Anal. Chem. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I. S. et al. Kombinasjon av MALDI-MSI og kassettdosering for evaluering av medikamentdistribusjon i human hudeksplantat. Anal. Bioanal. Chem. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et al. Identifikasjon av biologisk vev ved hurtig fordampende ioniseringsmassespektrometri. Anal. Chem. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et al. Intraoperativ vevsidentifikasjon ved bruk av hurtig fordampende ioniseringsmassespektrometri. Sci. Overs. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. et al. Identifikasjon av opprinnelsesarten for kjøttprodukter ved hurtig fordampende ioniseringsmassespektrometri. J. Agric. Food Chem. 64, 4793-4800 (2016).