通过质谱成像检测皮肤肿瘤生物标志物

1. 标题 通过质谱成像检测皮肤肿瘤生物标志物

2. 目标 2.1 问题定义 2018 年，全球有超过 100 万患者被诊断患有非黑色素瘤皮肤癌 (NMSC)，由于此类癌症缺乏登记或登记不完整，这一数字可能被低估[1]。 及时检测微小肿瘤在癌症诊断中至关重要。 我们相信，质谱成像（MSI）可以成功定位常见皮肤癌、基底细胞癌（BCC）和鳞状细胞癌（SCC）的微观聚集体，并将它们与邻近的离体正常皮肤区分开来。 MSI 揭示了 BCC 和 SCC 区域化学特征的改变（脂质模式），并且不依赖于组织病理学特征的视觉识别。

   2.2 假设 我们假设 NMSC 细胞表现出与皮肤活检切片中的健康皮肤组织不同的特定内源生物标志物（脂质模式）。 如果这一假设正确，未来将有可能利用质谱引导手术开发 NMSC 的实时组织诊断和治疗。

   2.3 结果衡量

   • 鉴定莫氏手术切除的基底细胞癌和鳞状细胞癌组织切片中选定脂质生物标志物的质量和分布。
   • 鉴定光化性角化病（癌前病变）活检切片中选定脂质生物标志物的质量和分布。

   2.4 背景 根据世界癌症研究基金会2019年皮肤癌报告，2018年非黑色素瘤皮肤癌（NMSC）发病率为100万人，被列为全球较常见的癌症[1]。 NMSC 主要吞噬基底细胞癌 (BCC) 和鳞状细胞癌 (SCC)。

   在丹麦和其他西方国家这些肿瘤的发生率也很高[2]，并且丹麦的发病率持续上升，每年达到15,000例。 NMSC 的主要危险因素是暴露于紫外线辐射 (UVR)。 浅肤色、浅色或红色头发、浅色眼睛和免疫功能低下的人是 NMSC 的其他确定原因 [1,3]。

   丹麦人口主要是皮肤白皙、地域流动性大且极其喜爱阳光，这增加了患皮肤癌的风险。 每天，约 44 名丹麦人接受 NMSC 诊断，包括基底细胞癌或鳞状细胞癌，其中 40% 在接下来的几年中发展出新肿瘤 [4] NMSC 死亡率较低，但由于其高患病率和复发率，患者发病率很高[2]，丹麦每年花费超过1900万欧元，超过了黑色素瘤的健康管理和医疗保健费用[5]。 NMSC 的护理主要由皮肤科医生进行，NMSC 的治疗可采用多种方式，如莫氏显微手术、切除、冷冻疗法和不同的局部治疗方式 [2]。

   Mohs显微手术的最低复发率使得这种切除手术成为高危NMSC治疗的首选[6]。 在这种显微镜引导的手术中，组织被切除、切片、染色，并由训练有素的病理学家进行评估。 患者在手术台上等待，同时检查组织边缘是否有癌细胞，这一发现促使进一步从治疗区域切除组织。 因此，由于每天可以治疗的患者数量有限并且需要训练有素的实验室工作人员，莫氏手术既耗时又昂贵。

   几十年来，实验室一直受益于质谱 (MS) 令人印象深刻的灵敏度和特异性。 MS 是一种成熟的分析技术，可电离化合物并根据其分子质量对其进行分类。 MS 成像 (MSI) 以类似的方式可视化分子的空间分布。 扫描整个组织切片（例如 皮肤）并生成每个单位区域的质谱，提供化合物的组织分布图。

   MSI 可以同时检测许多内源分子种类，包括脂质、小蛋白质以及以微小浓度分布在分析组织内的外源药物 [8]。

   Janfelt 及其同事 [10] 能够使用磷脂上的 MSI 来区分表皮和真皮。 我们将使用这种技术来识别皮肤肿瘤中存在但邻近正常皮肤中不存在（或以不同强度）的内源性肿瘤生物标志物。 将 MSI 集成到 NMSC 的诊断库中，利用该技术区分恶性和良性组织的实时、特定膜脂特征。

   如果能够识别能够区分恶性和健康皮肤的脂质模式，该项目的长期目标是引入快速蒸发电离质谱法 (REIMS)，现在也称为 iKnife [11]。 该方法通过直接识别化学肿瘤特征而不是简单的组织解剖学，有可能变得更加灵敏，而且劳动强度和耗时更少。 REIMS 技术由连接到质谱仪的电外科手机组成，能够利用电外科过程中产生的雾化组织进行实时组织识别。 通过将手术期间记录的质谱与预先存在的“参考库”自动匹配来实现组织识别。 该方式为外科医生提供了有关正在切割的组织类型的即时信息，通过以惊人的精度描绘癌症边缘来指导治疗。 脂质组学谱显示组织学肿瘤类型之间的差异，可以通过作为生物标志物来区分组织[12]。 REIMS 在其他领域也被证明是一种有效的确认产品真实性和质量的方法。 因此，在食品行业中，REIMS 用于在 3 秒内区分牛肉和马肉，准确率达到 100% [13]。

3. 方法 3.1 针对 BCC 和 SCC 患者的研究设计 当患者被转诊至 Bispebjerg 医院皮肤科进行莫氏手术时，切除 BCC 或 SCC，并对组织进行包埋、切片和染色，供莫氏外科医生评估是否有更多组织需要移除。 已移除的该组织的三个皮肤切片（5-10 微米厚）将用于我们的研究。 其中一个切片将进行 HE 染色，以便我们确切地知道感兴趣的区域在哪里。 两个部分将用于 MS 分析（MSI 谱图和 REIMS 谱图）。

   目前，我们正在Bispebjerg医院皮肤科进行高危BCC的莫氏手术，但一年内将包括SCC的莫氏手术。

   3.2 光化性角化病患者的研究设计 当患者被转诊到 Bispebjerg 医院皮肤科接受治疗多种光化性角化病（1、2 或 3 级）的手术时，我们将根据情况进行额外的穿刺活检（2-4 毫米）关于病变的大小。 活检被包埋并切片。 我们将使用 3 个皮肤部分（5-10 微米厚）。 其中一个切片将进行 HE 染色，以便我们确切地知道感兴趣的区域在哪里。 哥本哈根大学药学系将使用两个部分进行 MS 分析。 我们将纳入多达 100 名患者的光化性角化病。

   3.3 组织微阵列 上述 MSI 切片将提供有关单个肿瘤与邻近正常组织比较的知识。 然而，我们还需要对患者进行相互比较，因此我们需要制作组织微阵列。

   我们将从移除和嵌入的运动性角化病/基底细胞癌/鳞状细胞癌组织中制作组织微阵列。 将使用与上述相同的程序通过 MSI 分析一个切片，并对额外的切片进行 HE 染色以进行病理学评估和传统的免疫组织化学标记（如 Ki67 和 p53）。

4. 统计计算 将使用 Matlab 或类似程序对所有质谱进行多元统计分析。 线性判别分析将用于识别癌前组织、癌症组织和正常组织之间的光谱差异。 将通过留一患者交叉验证方案来记录分类性能。 样本数量基于样本量计算和之前关于其他癌症形式的出版物，估计足以生成参考库。 我们正在计划对配对研究对象的连续响应变量进行研究。 先前数据表明，匹配对的响应差异呈正态分布，标准差为 8。 如果匹配对的平均响应的真实差异为 3，我们将需要研究 58 对受试者才能拒绝零假设，即该响应差异为零，概率（功效）为 0,8。 与此原假设检验相关的 I 类错误概率为 0.05。 （用于样本量计算的编程；功效和样本量计算，PS，范德堡大学；版本 3.1.2）。 根据这些计算，我们将招募 60 至 100 名 BCC、AK 和 SCC 患者。 最少 180 名患者，最多 300 名患者。

5. 参与者 总共最多将招募 300 名患者参与该研究。 符合纳入和排除标准的 18 岁或以上的男性和女性均包括在内。 所有潜在患者都将从比斯佩约格大学医院皮肤科招募。

   感兴趣的患者将被邀请参加初步信息筛选访问，届时他们将收到主要研究者 Catharina Lerche、Mohs 外科医生 Martin Gluud 或项目护士 June Svendsen 提供的有关该研究的全面口头信息，并将分发书面信息。 会议将在单独的办公室举行，以确保安全和平静的环境。 患者被特别告知，如果他们愿意，他们可以带一名或多名评估员参加所有会议和干预措施。 书面知情同意书将在筛选访视后至少 24 小时后的外科手术日获得。

   每位患者将由研究者进行评估，以评估其是否适合进入研究。 为了确保光学比较的同质组，将根据以下标准进行招募：

   5.1 纳入标准 • 18 岁以上的患者。

   • 患有AK、SCC 和BCC 的患者。

   • 获得患者的书面知情同意书。

   5.2 排除标准 • 免疫抑制患者

6. 潜在风险和不良反应 所有患者都将以口头和书面形式被告知风险和可能的副作用。

   6.1 穿刺活检 对于 BCC 和 SCC 患者，我们将仅使用已通过标准莫氏手术切除的组织。 对于光化性角化病患者，将在局部麻醉下进行活检，直径为2、3或4毫米，深度为3毫米。 每次活检都会留下直径为 2 毫米或 4 毫米的圆形疤痕，并在 2 周内逐渐变小。 注射局部麻醉可能会导致注射部位疼痛和刺痛/刺痛感。 感染的可能性很小，但如果发生，我们会进行治疗。

7. 生物银行 将根据委员会法第 2 条第 2 款建立研究生物银行。 13. 所有可能的活检/切片将保存在 Bispebjerg 大学医院皮肤科的 -80 °C 冰箱中，直到在哥本哈根大学药学部（地址：Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen Ø）进行分析。 我们不能总是在 5-7 天内完成分析，因为制作一张 MSI 图片需要长达 20 小时，如果我们一天内有多名 BCC/SCC/光化性角化病患者，就会有延迟。 在制作组织微阵列时，我们将在分析前收集 6-8 名患者的组织。 MSI 分析后，样品将被销毁。 活检块和组织微阵列块的剩余部分的破坏将不晚于1。 2025 年 1 月。 不会保留任何组织用于非特异性研究。
8. 来自患者日记的信息 在筛选可能纳入本研究的患者时，卫生人员将使用患者日记中有关疑似病变病理学描述的信息。 患者签署知情同意书后，将使用患者日记中有关肿瘤类型、位置、大小以及是否复发病变的描述信息。

9. 数据保护、信息存储和质量控制 9.1 质量控制 赫尔辛基 II 的声明以及良好临床研究的标准将受到尊重。 将尊重患者的隐私以及身心健康。 该研究将在健康研究伦理委员会和丹麦数据保护局注册。

   9.2 数据保护和存储 将遵守一般数据保护条例（丹麦语：Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen）。 使用丹麦首都地区数据的研究被视为公共研究。 本研究中收集的数据的使用和分发将在同意过程中与患者讨论。 该项目将向丹麦数据保护合规知识中心（丹麦语：Videncenter for Dataanmeldelse，Region Hovedstaden）报告。 将制定筛选和患者名单，包括姓名、研究 ID 号和出生日期。 收集的所有数据都将进行匿名处理，并受丹麦有关个人信息管理的法律和丹麦健康法（丹麦语：Sundhidsloven）的保护。 研究终止后，数据将在 Bispebjerg 医院皮肤科登记并保存 5 年。

10. 财务考虑 该研究由首席研究员 Catharina M. Lerche 构思。 商业公司尚未设想提供任何财政支持。 Bispebjerg大学医院皮肤科将为首席研究员Catharina M Lerche提供工资。 与项目相关的其他费用由丹麦癌症协会（Knæk Cancer midler 1.6 mill DKK）和灵北基金会（10 mill DKK）承担。 首席研究员 Catharina M. Lerche 和合作者在丹麦癌症协会或灵北基金会没有任何个人关系或经济利益。
11. 报销 患者不会获得任何报销。

12. 向患者提供的信息 主要研究者 Catharina M. Lerche 负责提供有关研究目的、设计和风险的清晰口头和书面信息，如丹麦卫生部 (丹麦卫生部) 的“Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter”中所述。丹麦语：Sundheds- og Ældreministeriet）。 在不受干扰的环境中，参与者将意识到他们有权有一名/或多位评估员在场，参与者是自愿的，并且在研究期间可以随时退出。 患者将有足够的考虑时间（至少 24 小时）。 患者将被要求签署同意书。

    将敦促患者阅读随附的有关研究参与者权利的材料。 在参与者签署知情同意书之前，不会开始任何研究程序。 患者提出的其他问题将由联系人 Catharina M. Lerche 解答

13. 结果的公布 将公布阳性、阴性和不确定的结果。 目的是在同行评审的国际皮肤病学期刊或/和皮肤病学会议上发表和展示结果。 结果的知识产权属于比斯佩约格大学医院。 出版物将按照温哥华指南进行。
14. 伦理学 活检将在比斯佩约格大学医院皮肤科进行。 个人信息和样本根据《个人数据和健康法》进行处理。 此外，该项目的实施对参与者的健康和安全风险最小。

外科手术是世界各地医院和诊所的日常活动。 这项 NMSC 生物标志物研究和基于质谱的皮肤癌新疗法的开发有可能降低肿瘤复发、发病率和成本。 尚未进行 NMSC 生物标志物和 REIMS 在皮肤癌治疗中的临床实施的研究。 预计本研究中不良反应的潜在风险很小，并且具有改善肿瘤复发、发病率、成本、减少劳动密集型和耗时的潜在益处。 基于证据的未来收益的潜力以及本研究可能提供的未来前景，应考虑到参与者在活检期间的不适以及额外前往 Bispebjerg 医院的访问。 将遵守有关患者权利和赔偿的丹麦法律。

15. 比斯佩约格医院保险

16. 参考文献

1. 饮食、营养、身体活动和皮肤癌。 2018.
2. 兰伯格，A.L.等人。 丹麦非黑色素瘤皮肤癌皮肤病学数据库。 临床。 流行病。 8、633-636（2016）。
3. 詹森，A.等人。 饮酒可能会降低患非黑色素瘤皮肤癌的风险：丹麦一项大型前瞻性队列研究的结果。 J. 投资。 德玛托。 132, 2718-2726 (2012)。
4. Kyrgidis, A.、Tzellos, T. G.、Vahtsevanos, K. 和 Triaridis, S. 基底细胞癌的新概念。 人口统计学、临床、组织学风险因素和生物标志物。 关于肿瘤发展风险、二原发易感性和复发的证据的系统审查。 J.外科医生。 资源。 159, 545-556 (2010)。
5. 本特森，J.等人。 丹麦黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌的疾病费用。 欧元。 J. 癌症预防。 22, 569-576 (2013)。
6. Smeets，N.W.J. 等人。 莫氏显微手术治疗面部基底细胞癌 - 回顾性研究和文献综述的结果。 Br。 J.德马托尔。 151, 141-147 (2004)。

8.尼尔森，A.等人。 药物开发中的质谱成像。 肛门。 化学。 87、1437-1455（2015）。

10. Sørensen, I. S. 等人。 MALDI-MSI 和盒式给药相结合，用于评估人皮肤外植体中的药物分布。 肛门。 生物肛门。 化学。 409, 4993-5005 (2017)。

11.巴洛格，J.等人。 通过快速蒸发电离质谱法鉴定生物组织。 肛门。 化学。 82、7343-7350（2010）。

12.巴洛格，J.等人。 使用快速蒸发电离质谱法进行术中组织识别。 科学。 译。 医学。 5、（2013）。

13.巴洛格，J.等人。 通过快速蒸发电离质谱法鉴定肉制品的原产地物种。 J.阿格里克。 食品化学。 64、4793-4800（2016）。