Biomarqueurs de tumeurs cutanées par imagerie par spectrométrie de masse

1. Titre Biomarqueurs des tumeurs cutanées par imagerie par spectrométrie de masse

2. Objectif 2.1 Définition du problème Plus d'un million de patients ont reçu un diagnostic de cancer de la peau autre que le mélanome (NMSC) dans le monde en 2018 et ce nombre pourrait être sous-estimé en raison du manque de registres ou d'un enregistrement incomplet de ce type de cancer [1]. La détection rapide des tumeurs microscopiques est de la plus haute importance dans le diagnostic du cancer. Nous pensons que l'imagerie par spectrométrie de masse (MSI) peut localiser avec succès des agrégats microscopiques d'un cancer de la peau courant, d'un carcinome basocellulaire (CBC) et d'un carcinome épidermoïde (CSC), et de les distinguer de la peau normale adjacente ex vivo. MSI dévoile un profil chimique modifié dans la région BCC et SCC (modèles lipidiques) et ne s'appuie pas sur l'identification visuelle des caractéristiques histopathologiques.

   2.2 Hypothèse Nous émettons l'hypothèse que les cellules NMSC présentent des biomarqueurs endogènes spécifiques (modèles lipidiques) qui diffèrent des tissus cutanés sains dans des sections de biopsies cutanées. Si cette hypothèse est correcte, il sera possible à l'avenir de développer un diagnostic tissulaire et un traitement en temps réel du NMSC en utilisant une chirurgie guidée par spectrométrie de masse.

   2.3 Mesures des résultats

   • Identification des masses et des distributions de biomarqueurs lipidiques sélectionnés dans des coupes de tissus BCC et SCC retirés de la chirurgie de Mohs.
   • Identification des masses et des distributions de biomarqueurs lipidiques sélectionnés dans des coupes de biopsies présentant des kératoses actiniques (lésions pré-cancéreuses).

   2.4 Contexte L'incidence du cancer de la peau autre que le mélanome (NMSC) était de 1 million de personnes en 2018, selon le rapport sur le cancer de la peau de 2019 du World Cancer Research Fund, classé comme le cancer le plus fréquent dans le monde [1]. Le NMSC englobe principalement le carcinome basocellulaire (CBC) et le carcinome épidermoïde (CSC).

   Au Danemark et dans d'autres pays occidentaux, la fréquence de ces tumeurs est également élevée [2], et l'incidence danoise continue d'augmenter, s'élevant à 15 000 par an. Le principal facteur de risque du NMSC est l’exposition aux rayons ultraviolets (UVR). La peau claire, les cheveux clairs ou roux, les yeux clairs et les personnes immunodéprimées sont d'autres causes établies de NMSC [1,3].

   La population danoise est majoritairement à la peau claire, géographiquement mobile et extrêmement amoureuse du soleil, ce qui augmente les risques de développer un cancer de la peau. Chaque jour, environ 44 Danois reçoivent un diagnostic de NMSC, composé soit de CBC, soit de SCC, et 40 % d'entre eux développent de nouvelles tumeurs au cours des années suivantes. [4] Le NMSC a une faible mortalité, mais il présente une morbidité notable chez les patients en raison de sa prévalence et de sa récidive élevées. [2], coûtant plus de 19 millions d'euros par an au Danemark, dépassant le coût de la gestion de la santé et les coûts des soins de santé du mélanome [5]. Les soins pour les NMSC sont principalement assurés par des dermatologues, et plusieurs modalités peuvent être utilisées pour le traitement des NMSC, telles que la chirurgie micrographique de Mohs, l'excision, la cryothérapie et différentes modalités topiques [2].

   Les taux de récidive les plus faibles de la chirurgie micrographique de Mohs font de cette chirurgie excisionnelle le traitement de premier choix des CPNM à haut risque [6]. Au cours de cette chirurgie guidée au microscope, les tissus sont excisés, sectionnés, colorés et évalués par un pathologiste qualifié. Le patient attend sur la table d'opération pendant que les marges des tissus sont inspectées à la recherche de cellules cancéreuses, une découverte qui entraîne un retrait supplémentaire des tissus de la zone de traitement. En conséquence, la chirurgie de Mohs prend du temps et est coûteuse, en raison du nombre limité de patients pouvant être traités par jour et du besoin de personnel de laboratoire hautement qualifié.

   Depuis des décennies, les laboratoires bénéficient de la sensibilité et de la spécificité impressionnantes de la spectrométrie de masse (MS). Technique analytique bien établie, la MS ionise les composés et les trie en fonction de leur masse moléculaire. L'imagerie MS (MSI) visualise la distribution spatiale des molécules de la même manière. Scanner des coupes de tissus entières (par ex. peau) et générant un spectre de masse pour chaque zone unitaire, une carte de la distribution tissulaire d'un composé est fournie.

   MSI peut détecter simultanément de nombreuses espèces moléculaires endogènes, notamment des lipides, de petites protéines, ainsi que des médicaments pharmaceutiques exogènes distribués en concentrations infimes dans les tissus analysés [8].

   Janfelt et ses collègues [10] ont pu faire la distinction entre l'épiderme et le derme en utilisant le MSI sur les phospholipides. Nous utiliserons cette technique pour identifier les biomarqueurs tumoraux endogènes présents dans les tumeurs cutanées mais non présents (ou à différentes intensités) dans la peau normale adjacente. Intégrer le MSI dans l'arsenal diagnostique du NMSC, en utilisant la technologie pour différencier en temps réel les signatures lipidiques membranaires spécifiques des tissus malins et bénins.

   L’objectif à long terme au-delà de ce projet, s’il est possible d’identifier des profils lipidiques capables de distinguer une peau maligne d’une peau saine, est d’introduire la spectrométrie de masse par ionisation par évaporation rapide (REIMS), également désormais connue sous le nom d’iKnife [11]. Cette méthode a le potentiel d’être beaucoup plus sensible en identifiant directement les signatures chimiques de la tumeur plutôt que la simple anatomie des tissus, en plus d’être moins laborieuse et moins longue. La technique REIMS consiste en une pièce à main électrochirurgicale connectée à un spectromètre de masse, capable d'effectuer une identification des tissus en temps réel à l'aide du tissu en aérosol produit lors de l'électrochirurgie. L'identification des tissus est obtenue par mise en correspondance automatisée des spectres de masse enregistrés pendant la chirurgie avec une « bibliothèque de référence » préexistante. Cette modalité fournit au chirurgien des informations immédiates sur le type de tissu à couper, guidant le traitement en délimitant les marges du cancer avec une précision étonnante. Les profils lipidomiques ont montré des variations entre les types histologiques de tumeurs, permettant de distinguer les tissus en agissant comme biomarqueurs [12]. REIMS s'est également révélé efficace dans d'autres domaines pour affirmer l'authenticité et la qualité des produits. Ainsi, dans l’industrie alimentaire, REIMS est utilisé pour distinguer la viande de bœuf de la viande de cheval en moins de 3 secondes, avec une précision de 100 % [13].

3. Méthode 3.1 Conception de l'étude pour les patients atteints de CBC et de CSC Lorsque les patients sont référés pour une intervention chirurgicale de Mohs au service de dermatologie de l'hôpital de Bispebjerg, les CBC ou les CSC sont retirés et les tissus sont incorporés, sectionnés et colorés pour que le chirurgien de Mohs puisse évaluer s'il y a plus de tissu. doit être retiré. Trois coupes de peau (5 à 10 µm d'épaisseur) de ce tissu déjà retiré seront utilisées dans notre étude. Une section sera colorée HE afin que nous sachions exactement où se trouvent les régions d’intérêt. Deux sections seront utilisées pour l'analyse MS (spectre MSI et spectre REIMS).

   Actuellement, nous pratiquons la chirurgie de Mohs sur les CBC à haut risque au département de dermatologie de l'hôpital de Bispebjerg, mais la chirurgie de Mohs sur les CSC sera incluse d'ici un an.

   3.2 Conception de l'étude pour les patients atteints de kératoses actiniques Lorsque les patients sont référés pour une procédure visant à traiter plusieurs kératoses actiniques (grade 1, 2 ou 3) au service de dermatologie de l'hôpital de Bispebjerg, nous effectuerons une biopsie supplémentaire à l'emporte-pièce (2-4 mm) en fonction sur la taille de la lésion. La biopsie est intégrée et sectionnée. Nous utiliserons 3 sections de peau (5 à 10 um d'épaisseur). Une section sera colorée HE afin que nous sachions exactement où se trouvent les régions d’intérêt. Deux sections seront utilisées pour l'analyse MS au Département de pharmacie de l'Université de Copenhague. Nous inclurons les kératoses actiniques provenant d'un maximum de 100 patients.

   3.3 Puce à ADN tissulaire La coupe mentionnée ci-dessus pour MSI fournira des connaissances sur une seule tumeur par rapport au tissu normal adjacent. Cependant, nous devons également comparer les patients entre eux et nous devons donc créer une puce à ADN tissulaire.

   Nous fabriquerons la micropuce tissulaire à partir des tissus de kératoses aktiniques/BCC/SCC retirés et intégrés. Une section sera analysée par MSI avec la même procédure que celle décrite ci-dessus et des sections supplémentaires seront colorées à l'HE pour l'évaluation pathologique et les marqueurs immunohistochimiques traditionnels comme Ki67 et p53.

4. Calculs statistiques Une analyse statistique multivariée sera effectuée sur tous les spectres de masse à l'aide de Matlab ou d'un programme similaire. Une analyse discriminante linéaire sera utilisée pour identifier les différences spectrales entre les tissus précancéreux, cancéreux et normaux. Les performances de classification seront enregistrées avec un système de validation croisée sans patient. Le nombre d'échantillons est basé sur le calcul de la taille de l'échantillon et sur des publications antérieures sur d'autres formes de cancer et est estimé suffisant pour générer une bibliothèque de référence. Nous prévoyons une étude d'une variable à réponse continue à partir de paires appariées de sujets d'étude. Les données antérieures indiquent que la différence dans la réponse des paires appariées est normalement distribuée avec un écart type de 8. Si la vraie différence dans la réponse moyenne des paires appariées est de 3, nous devrons étudier 58 paires de sujets pour pouvoir rejeter l'hypothèse nulle selon laquelle cette différence de réponse est nulle avec une probabilité (puissance) de 0,8. La probabilité d'erreur de type I associée à ce test de cette hypothèse nulle est de 0,05. (programmé utilisé pour le calcul de la taille de l'échantillon ; calcul de la puissance et de la taille de l'échantillon, PS, Vanderbilt University ; version 3.1.2). Sur la base de ces calculs, nous recruterons entre 60 et 100 patients atteints de CBC, AK et SCC. Le minimum sera de 180 patients et le maximum de 300 patients.

5. Participants Au total, 300 patients maximum seront recrutés pour participer à l'étude. Les hommes et les femmes âgés de 18 ans ou plus qui répondent aux critères d'inclusion et d'exclusion sont inclus. Tous les patients potentiels seront recrutés dans le département de dermatologie de l'hôpital universitaire de Bispebjerg.

   Les patients intéressés seront invités à une visite de sélection d'informations préliminaire au cours de laquelle ils recevront des informations orales complètes sur l'étude par l'investigateur principal, Catharina Lerche, le chirurgien de Mohs Martin Gluud ou l'infirmière du projet June Svendsen, et des informations écrites seront distribuées. La réunion aura lieu dans un bureau séparé pour garantir un environnement sûr et calme. Les patients sont spécifiquement informés qu'ils peuvent être accompagnés d'un ou plusieurs évaluateurs à toutes les réunions et interventions s'ils le souhaitent. Le consentement éclairé écrit sera obtenu à l'inclusion le jour de l'intervention chirurgicale qui aura lieu au moins 24 heures après la visite de dépistage.

   Chaque patient sera évalué par l'investigateur pour évaluer l'opportunité d'entrer dans l'étude. Afin d'assurer un groupe homogène de comparaison optique, le recrutement sera effectué selon les critères suivants :

   5.1 Critères d'inclusion • Patients de plus de 18 ans.

   • Patients présentant des AK, des SCC et des BCC.

   • Consentement éclairé écrit obtenu du patient.

   5.2 Critères d'exclusion • Patients immunodéprimés

6. Risque potentiel et effets indésirables Tous les patients seront informés verbalement et par écrit des risques et des effets secondaires possibles.

   6.1 Biopsie à l'emporte-pièce Pour les patients atteints de CBC et de CSC, nous n'utiliserons que les tissus déjà retirés par la procédure standard de Mohs. Pour les patients atteints de kératoses actiniques, une biopsie sera réalisée sous anesthésie locale, de 2, 3 ou 4 mm de diamètre et 3 mm de profondeur. Chaque biopsie laissera une cicatrice ronde de 2 mm ou 4 mm de diamètre qui se creuse en 2 semaines. L'injection d'une anesthésie locale peut provoquer une douleur et une sensation de picotement/picotement au site d'injection. Il y a un risque minime d’infection, mais nous le traiterons si cela se produit.

7. Biobanque Une biobanque de recherche sera créée conformément à la loi-comité §2 nr. 13. Toutes les biopsies/coupes potentielles seront conservées dans un congélateur verrouillé à -80 °C au département de dermatologie, hôpital universitaire de Bispebjerg jusqu'à analyse au département de pharmacie, Université de Copenhague, Universitetsparken 2, 2100 Copenhague Ø. Nous ne pouvons pas toujours effectuer l'analyse dans un délai de 5 à 7 jours car cela prend jusqu'à 20 heures pour créer une image MSI et si nous avons plusieurs patients atteints de BCC/SCC/kératoses actiniques en une journée, il y aura un retard. Lors de la fabrication de la puce à ADN tissulaire, nous collecterons les tissus de 6 à 8 patients avant analyse. Après analyse MSI, les échantillons seront détruits. La destruction des parties restantes des blocs de biopsie et des blocs de microréseaux tissulaires aura lieu au plus tard en 1. Janvier 2025. Aucun tissu ne sera conservé à des fins de recherche non spécifique.
8. Informations provenant des journaux de patients Le personnel de santé utilisera les informations concernant la description pathologique de la lésion suspectée du journal des patients lors de la sélection des patients potentiels à inclure dans cette étude. Une fois le consentement éclairé signé par le patient, les informations du journal du patient concernant la description du type de tumeur, de son emplacement, de sa taille et s'il s'agit d'une lésion récurrente seront utilisées.

9. Protection des données, stockage des informations et contrôle qualité 9.1 Contrôle qualité La déclaration d'Helsinki II sera respectée, ainsi que les normes de bonne recherche clinique. Le respect de la vie privée ainsi que l'intégrité physique et mentale des patients seront maintenus. L'étude sera enregistrée auprès du Comité d'éthique de la recherche en santé et de la protection de l'Agence danoise des données.

   9.2 Protection et stockage des données Le règlement général sur la protection des données (danois : Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) sera respecté. La recherche utilisant les données de la région de la capitale du Danemark est considérée comme une recherche publique. L'utilisation et la distribution des données collectées dans cette étude seront discutées avec les patients pendant le processus de consentement. Le projet sera signalé au Centre danois de connaissances sur la conformité en matière de protection des données (danois : Videncenter for Dataanmeldelse, Région Hovedstaden). Une liste des patients dépistés et des patients comprenant les noms, le numéro d'identification de l'étude et la date de naissance sera établie. Toutes les données collectées seront anonymisées et protégées par la loi danoise concernant la gestion des informations personnelles et par la loi danoise sur la santé (danois : Sundhedsloven). Les données seront enregistrées et conservées pendant 5 ans après la fin de l'étude au service de dermatologie de l'hôpital Bispebjerg.

10. Considérations financières L'étude est conçue par la chercheuse principale Catharina M. Lerche. Aucun soutien financier n'a été conçu par les sociétés commerciales. Le département de dermatologie de l'hôpital universitaire de Bispebjerg assurera le salaire de la chercheuse principale Catharina M Lerche. Les autres dépenses liées au projet sont couvertes par la Société danoise du cancer (Knæk Cancer midler 1,6 million DKK) et la Fondation Lundbeck (10 million DKK). La chercheuse principale Catharina M. Lerche et les collaborateurs n'ont aucune relation personnelle ni intérêt économique dans la Société danoise du cancer ou la Fondation Lundbeck.
11. Remboursements Il n'y aura aucun remboursement aux patients.

12. Informations aux patients L'investigatrice principale, Catharina M. Lerche, est chargée de donner des informations claires, verbales et écrites, sur l'objectif, la conception et les risques de l'étude, comme indiqué dans "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" du ministère danois de la Santé ( danois : Sundheds- og Ældreministeriet). Dans un cadre paisible, le participant sera informé de son droit à la présence d'un ou plusieurs évaluateurs, que le participant est volontaire et que le retrait est possible à tout moment au cours de l'étude. Les patients bénéficieront d'un temps de réflexion adéquat (minimum 24 heures). Les patients seront invités à signer un formulaire de consentement.

    Le patient sera invité à lire le matériel ci-joint à droite du participant à l'étude. Aucune procédure d'étude ne sera lancée avant que les participants n'aient signé le consentement éclairé. Les questions supplémentaires des patients seront traitées par la personne contact, Catharina M. Lerche.

13. Publication des résultats Les résultats positifs, négatifs et non concluants seront publiés. L'objectif est de publier et de présenter les résultats dans une revue internationale de dermatologie à comité de lecture ou/et lors de conférences dermatologiques. Les droits de propriété intellectuelle sur les résultats appartiennent à l’hôpital universitaire de Bispebjerg. Les publications seront conformes aux lignes directrices de Vancouver.
14. Éthique Les biopsies seront réalisées au département de dermatologie de l'hôpital universitaire de Bispebjerg. Les informations personnelles et les échantillons sont traités conformément à la loi sur les données personnelles et à la santé. Le projet est en outre réalisé avec un minimum de risques pour la santé et la sécurité des participants.

Les interventions chirurgicales sont des événements quotidiens dans les hôpitaux et cliniques du monde entier. Cette étude des biomarqueurs NMSC et le développement d'un nouveau traitement du cancer de la peau basé sur la spectrométrie de masse ont le potentiel de réduire la récidive tumorale, la morbidité et les coûts. Une étude des biomarqueurs NMSC et de la mise en œuvre clinique de REIMS dans le traitement du cancer de la peau n'a pas encore été réalisée. On s'attend à ce que les risques potentiels d'effets indésirables dans cette étude soient faibles et qu'il existe un avantage potentiel d'amélioration de la récidive tumorale, de la morbidité, des coûts, moins de main-d'œuvre et de temps. Le potentiel de gains futurs fondés sur des preuves et les perspectives futures que cette étude peut offrir doivent être pris en compte par rapport à l'inconfort des participants lors de la biopsie et de la visite supplémentaire à l'hôpital de Bispebjerg. Les lois danoises concernant les droits des patients et l'indemnisation seront respectées.

15. Assurance Hôpital Bispebjerg

16. Références

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2. Lamberg, AL et al. La base de données danoise sur la dermatologie du cancer de la peau autre que le mélanome. Clin. Épidémiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et coll. La consommation d'alcool peut modifier le risque de cancer de la peau autre que le mélanome : résultats d'une vaste étude de cohorte prospective danoise. J. Investir. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, TG, Vahtsevanos, K. et Triaridis, S. Nouveaux concepts pour le carcinome basocellulaire. Facteurs de risque démographiques, cliniques, histologiques et biomarqueurs. Un examen systématique des preuves concernant le risque de développement de tumeurs, la susceptibilité à la deuxième primaire et la récidive. J. Surg. Rés. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et coll. Coûts de la maladie pour le mélanome et le cancer de la peau non mélanique au Danemark. EUR. J. Cancer Précédent. 22, 569-576 (2013).
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8. Nilsson, A. et coll. Imagerie par spectrométrie de masse dans le développement de médicaments. Anal. Chimique. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, IS et al. Combinaison de MALDI-MSI et de dosage par cassette pour l'évaluation de la distribution du médicament dans les explants de peau humaine. Anal. Bioanal. Chimique. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et coll. Identification de tissus biologiques par spectrométrie de masse à ionisation évaporative rapide. Anal. Chimique. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et coll. Identification peropératoire des tissus par spectrométrie de masse à ionisation par évaporation rapide. Sci. Trad. Méd. 5, (2013).

13. Balog, J. et coll. Identification des espèces d'origine des produits carnés par spectrométrie de masse à ionisation par évaporation rapide. J. Agric. Chimie alimentaire. 64, 4793-4800 (2016).