Hudtumörbiomarkörer av masspektrometrisk bildbehandling

1. Titel Hudtumörbiomarkörer genom masspektrometri

2. Syfte 2.1 Problemdefinition Mer än 1 miljon patienter diagnostiserades med icke-melanom hudcancer (NMSC) världen över under 2018 och detta antal kan underskattas på grund av bristen på register eller ofullständig registrering av denna typ av cancer [1]. Tidig upptäckt av mikroskopiska tumörer är av yttersta vikt vid cancerdiagnostik. Vi tror att masspektrometrisk avbildning (MSI) framgångsrikt kan lokalisera mikroskopiska aggregat av en vanlig hudcancer, basalcellscancer (BCC) och skivepitelcancer (SCC), och skilja dem från närliggande normal hud ex-vivo. MSI avslöjar en förändrad kemisk profil i BCC- och SCC-regionen (lipidmönster) och förlitar sig inte på visuell identifiering av histopatologiska egenskaper.

   2.2 Hypotes Vi antar att NMSC-celler uppvisar specifika, endogena biomarkörer (lipidmönster) som skiljer sig från frisk hudvävnad i delar av hudbiopsier. Om den hypotesen är korrekt kommer det i framtiden att vara möjligt att utveckla vävnadsdiagnos och behandling av NMSC i realtid med hjälp av masspektrometristyrd kirurgi.

   2.3 Resultatmått

   • Identifiering av massor och distributioner av utvalda lipidbiomarkörer i sektioner från borttagen BCC- och SCC-vävnad från Mohs-kirurgi.
   • Identifiering av massor och distributioner av utvalda lipidbiomarkörer i snitt från biopsier med aktiniska keratoser (premaligna lesioner).

   2.4 Bakgrund Incidensen av icke-melanom hudcancer (NMSC) var 1 miljon människor 2018, enligt Skin Cancer Report of 2019 av World Cancer Research Fund, som klassificeras som den vanligare förekommande cancern i världen [1]. NMSC omfattar främst basalcellscancer (BCC) och skivepitelcancer (SCC).

   I Danmark och andra västländer är förekomsten av dessa tumörer också hög [2], och den danska incidensen fortsätter att öka och uppgår till 15 000 per år. Den främsta riskfaktorn för NMSC är exponering för ultraviolett strålning (UVR). Ljus hudfärg, ljust eller rött hår, ljus ögonfärg och immunförsvagade personer är andra etablerade orsaker till NMSC [1,3].

   Den danska befolkningen är övervägande ljushy, geografiskt rörlig och extremt solälskande, vilket ökar riskerna för att utveckla hudcancer. Varje dag får ~44 danskar en NMSC-diagnos, bestående av antingen BCC eller SCC, med 40% utveckla nya tumörer under de följande åren [4] NMSC har en låg dödlighet, men den har en anmärkningsvärd patientmorbiditet på grund av dess höga prevalens och återfall [2], kostar mer än 19 miljoner euro årligen för Danmark, vilket överstiger kostnaderna för hälsovård och vårdkostnader för melanom [5]. Vård för NMSC sker i första hand av hudläkare och flera metoder kan användas vid behandling av NMSC, såsom Mohs mikrografisk kirurgi, excision, kryoterapi och olika topikala modaliteter [2].

   De lägsta återfallsfrekvenserna av Mohs mikrografisk kirurgi gör denna excisionskirurgi till det första valet av behandling för högrisk NMSC [6]. Under denna mikroskopstyrda operation skärs vävnad ut, snittas, färgas och utvärderas av en utbildad patolog. Patienten väntar på operationsbordet medan vävnadsmarginalerna inspekteras för cancerceller, ett fynd som föranleder ytterligare vävnadsborttagning från behandlingsområdet. Följaktligen är Mohs operation tidskrävande och dyr, på grund av ett begränsat antal patienter som kan behandlas per dag och behovet av högutbildad laboratoriepersonal.

   I decennier har laboratorier dragit nytta av den imponerande känsligheten och specificiteten hos masspektrometri (MS). En väletablerad analysteknik, MS joniserar föreningar och sorterar dem baserat på deras molekylmassa. MS-avbildning (MSI) visualiserar den rumsliga fördelningen av molekyler på ett liknande sätt. Skanna hela vävnadssektioner (t.ex. hud) och generering av ett masspektrum för varje enhetsarea tillhandahålls en karta över en förenings vävnadsfördelning.

   MSI kan detektera många endogena molekylära arter samtidigt, inklusive lipider, små proteiner, såväl som exogena farmaceutiska läkemedel fördelade i små koncentrationer inom analyserad vävnad [8].

   Janfelt och kollegor [10] kunde skilja mellan epidermis och dermis med hjälp av MSI på fosfolipider. Vi kommer att använda denna teknik för att identifiera endogena tumörbiomarkörer som finns i hudtumörer men som inte finns (eller i olika intensiteter) i intilliggande normal hud. Integrering av MSI i den diagnostiska arsenalen för NMSC, med hjälp av tekniken för att i realtid differentiera specifika membranlipidsignaturer av malign och godartad vävnad.

   Det långsiktiga målet bortom detta projekt, om det är möjligt att identifiera lipidmönster som kan särskilja malign och frisk hud, är att introducera Rapid Evaporation Ionization Mass Spectrometry (REIMS), även nu som iKnife [11]. Denna metod har potential att bli mycket känsligare genom att direkt identifiera kemiska tumörsignaturer snarare än enkel vävnadsanatomi, förutom att vara mindre arbetskrävande och tidskrävande. REIMS-tekniken består av ett elektrokirurgiskt handstycke kopplat till en masspektrometer, som kan utföra vävnadsidentifiering i realtid med hjälp av den aerosoliserade vävnaden som produceras under elektrokirurgi. Vävnadsidentifiering uppnås genom automatiserad matchning av masspektra som registrerats under operationen, med ett redan existerande "referensbibliotek". Modaliteten ger kirurgen omedelbar information om vilken typ av vävnad som skärs, vägleder behandlingen genom att avgränsa cancermarginaler med häpnadsväckande precision. Lipidomiska profiler visade variation mellan histologiska tumörtyper, vilket möjliggjorde distinktion av vävnader genom att fungera som biomarkörer [12]. REIMS har också visat sig vara effektivt inom andra områden som ett sätt att bekräfta produktens äkthet och kvalitet. I livsmedelsindustrin används således REIMS för att skilja mellan nötkött och hästkött på <3 sekunder, med en noggrannhet på 100 % [13].

3. Metod 3.1 Studiedesign för patienter med BCC och SCC När patienter remitteras till Mohs kirurgiska ingrepp vid dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Hospital, tas BCCs eller SCCs bort och vävnaden bäddas in, snittas och färgas för Mohs kirurg att utvärdera om mer vävnad måste tas bort. Tre hudsektioner (5-10 um tjocka) av denna vävnad som redan är borttagen kommer att användas i vår studie. En sektion kommer att HE-färgas så att vi vet exakt var de intressanta regionerna finns. Två sektioner kommer att användas för MS-analys (MSI-spektrum och REIMS-spektrum).

   För närvarande gör vi Mohs-kirurgi på högrisk-BCC på dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Hospital, men Mohs Surgery of SCC kommer att inkluderas inom ett år.

   3.2 Studiedesign för patienter med aktiniska keratoser När patienter remitteras till ett ingrepp för att ha behandlat flera aktiniska keratoser (grad 1, 2 eller 3) vid dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Hospital kommer vi att ta en extra punchbiopsi (2-4 mm) beroende på på skadans storlek. Biopsien är inbäddad och sektionerad. Vi kommer att använda 3 hudsektioner (5-10 um tjocka). En sektion kommer att HE-färgas så att vi vet exakt var de intressanta regionerna finns. Två sektioner kommer att användas för MS-analys vid Institutionen för farmaci, Köpenhamns universitet. Vi kommer att inkludera aktiniska keratoser från upp till 100 patienter.

   3.3 Vävnadsmikroarray Ovan nämnda snittning för MSI kommer att ge kunskap om en enskild tumör i jämförelse med den intilliggande normala vävnaden. Men vi behöver också jämföra patienter med varandra och därför behöver vi göra en vävnadsmikroarray.

   Vi kommer att göra vävnadsmikroarrayen från den borttagna och inbäddade Aktinic keratos/BCC/SCC-vävnaden. En sektion kommer att analyseras av MSI med samma procedur som beskrivits ovan och extra sektioner kommer att HE-färgas för patologiutvärdering och traditionella immunhistokemimarkörer som Ki67 och p53.

4. Statistiska beräkningar Multivariat statistisk analys kommer att utföras på alla masspektra med Matlab eller liknande program. Linjär diskriminantanalys kommer att användas för att identifiera spektrala skillnader mellan pre-malign, cancer och normal vävnad. Klassificeringsprestanda kommer att registreras med ett korsvalideringsschema för lämna-en-patient-ut. Antalet prover baseras på provstorleksberäkning och tidigare publikationer om andra cancerformer och uppskattas vara tillräckligt för att generera ett referensbibliotek. Vi planerar en studie av en kontinuerlig svarsvariabel från matchade par av studieämnen. Tidigare data indikerar att skillnaden i svaret för matchade par är normalfördelad med standardavvikelse 8. Om den sanna skillnaden i medelsvaret för matchade par är 3, kommer vi att behöva studera 58 par av försökspersoner för att kunna förkasta nollhypotesen att denna svarsskillnad är noll med sannolikheten (potens) 0,8. Sannolikheten för typ I-fel förknippad med detta test av denna nollhypotes är 0,05. (programmerad för beräkning av provstorlek; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; version 3.1.2). Baserat på dessa beräkningar kommer vi att rekrytera mellan 60 och 100 patienter med BCC, AK och SCC. Minst kommer att vara 180 patienter och maximalt 300 patienter.

5. Deltagare Totalt kommer maximalt 300 patienter att rekryteras för att delta i studien. Män och kvinnor i åldern 18 år eller äldre som uppfyller kriterierna för inkludering och uteslutning ingår. Alla potentiella patienter kommer att rekryteras från dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Universitetssjukhus.

   Intresserade patienter kommer att bjudas in till ett preliminärt informationsscreeningbesök där de kommer att få omfattande muntlig information om studien av primärutredaren Catharina Lerche, Mohs kirurg Martin Gluud eller projektsjuksköterskan June Svendsen och skriftlig information kommer att delas ut. Mötet kommer att äga rum på ett separat kontor för att säkerställa en trygg och lugn miljö. Patienterna informeras specifikt om att de kan ta med en eller flera bedömare till alla möten och insatser om de så önskar. Skriftligt informerat samtycke kommer att säkerställas vid införandet på den kirurgiska ingreppsdagen som kommer att äga rum minst 24 timmar efter screeningbesöket.

   Varje patient kommer att utvärderas av utredaren för att bedöma lämpligheten att delta i studien. För att säkerställa en homogen grupp av optisk jämförelse kommer rekryteringen att utföras enligt följande kriterier:

   5.1 Inklusionskriterier • Patienter över 18 år.

   • Patienter som uppvisar AK, SCC och BCC.

   • Skriftligt informerat samtycke från patienten.

   5.2 Uteslutningskriterier • Immunsupprimerade patienter

6. Potentiella risker och biverkningar Alla patienter kommer att informeras både muntligt och skriftligt om risker och eventuella biverkningar.

   6.1 Stansbiopsi För patienter med BCC och SCC kommer vi endast att använda vävnad som redan har tagits bort enligt Mohs standardprocedure. För patienter med aktinisk keratos kommer en biopsi att tas under lokalbedövning, med 2, 3 eller 4 mm i diameter och 3 mm på djupet. Varje biopsi kommer att lämna ett runt ärr på 2 mm eller 4 mm i diameter som backar inom 2 veckor. Injektion av lokalbedövning kan orsaka smärta och en stickande/stickande känsla på injektionsstället. Det finns en minimal risk för infektion, men vi kommer att behandla det om det inträffar.

7. Biobank En forskningsbiobank kommer att upprättas i enlighet med kommittélagen §2 nr. 13. Alla potentiella biopsier/snitt kommer att förvaras i en låst -80 °C frys på Dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Universitetssjukhus fram till analys på Farmaciavdelningen, Köpenhamns Universitet, Universitetsparken 2, 2100 Köpenhamn Ø. Vi kan inte alltid göra analysen inom 5-7 dagar eftersom det tar upp till 20 timmar att göra en MSI-bild och om vi har flera BCC/SCC/Actinic keratospatienter på en dag blir det en fördröjning. När vi gör vävnadsmikroarrayen kommer vi att samla in vävnad från 6-8 patienter före analys. Efter MSI-analys kommer proverna att förstöras. Destruktion av återstående delar av biopsiblock och vävnadsmikroarrayblock kommer inte att vara senare än 1. januari 2025. Ingen vävnad kommer att behållas för ospecifik forskning.
8. Information från patientjournaler Hälsopersonal kommer att använda information om patologibeskrivningen av den misstänkta lesionen från patientjournalen vid screening av eventuella patienter som ska inkluderas i denna studie. Efter att det informerade samtycket är undertecknat av patienten kommer information från patientjournalen om beskrivning av tumörtyp, lokalisering, storlek och om det är återkommande lesion att användas.

9. Dataskydd, informationslagring och kvalitetskontroll 9.1 Kvalitetskontroll Helsingfors II:s deklaration kommer att respekteras, liksom normerna för god klinisk forskning. Respekten för integriteten samt patienternas fysiska och mentala integritet kommer att upprätthållas. Studien kommer att registreras hos Kommittén för hälsoforskningsetik och den danska datamyndighetens skydd.

   9.2 Dataskydd och lagring Allmän dataskyddsförordning (danska: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) kommer att respekteras. Forskning som använder Region Hovedstadens data betraktas som offentlig forskning. Användning och distribution av data som samlats in i denna studie kommer att diskuteras med patienter under samtyckesprocessen. Projektet kommer att rapporteras till det danska Knowledge Centre on Data Protection Compliance (danska: Videncenter for Dataanmeldelse, Region Hovedstaden). Lista över screenade och patienter inklusive namn, studie-ID-nummer och födelsedatum kommer att utarbetas. All data som samlas in kommer att anonymiseras och skyddas av dansk lag angående hantering av personlig information och den danska hälsolagen (danska: Sundhedsloven). Data kommer att registreras och lagras i 5 år efter avslutad studie på dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Hospital.

10. Ekonomiska överväganden Studien är utformad av huvudforskaren Catharina M. Lerche. Inget ekonomiskt stöd har utarbetats av kommersiella företag. Dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Universitetssjukhus kommer att ge lön till huvudutredaren Catharina M Lerche. Övriga kostnader relaterade till projektet täcks av den danska cancerforeningen (Knæk Cancer midler 1,6 miljoner DKK) och Lundbeckfonden (10 miljoner DKK). Huvudutredaren Catharina M. Lerche och samarbetspartnerna har ingen personlig relation eller ekonomiskt intresse i Cancerföreningen eller Lundbeckfonden.
11. Ersättningar Det kommer inga ersättningar till patienterna.

12. Information till patienter Primärutredaren, Catharina M. Lerche, ansvarar för att ge tydlig muntlig och skriftlig information om studiens syfte, utformning och risker, som anges i "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" av det danska hälsoministeriet ( Danska: Sundheds- og Ældreministeriet). I en ostörd miljö kommer deltagaren att göras medveten om sin rätt att ha en/eller flera bedömare närvarande, att deltagaren är frivillig och att det är möjligt att dra sig ur när som helst under studien. Patienterna kommer att få tillräcklig övervägandetid (minst 24 timmar). Patienterna kommer att uppmanas att underteckna ett samtyckesformulär.

    Patienten kommer att uppmanas att läsa bifogat material om studiedeltagares rätt. Inga studieprocedurer kommer att påbörjas innan deltagarna har undertecknat det informerade samtycket. Ytterligare frågor från patienter besvaras av kontaktpersonen Catharina M. Lerche

13. Publicering av resultat Positiva, negativa och ofullständiga resultat kommer att publiceras. Syftet är att publicera och presentera resultaten i en peer-reviewed internationell dermatologitidskrift eller/och vid dermatologiska konferenser. De immateriella rättigheterna till resultaten tillhör Bispebjerg University Hospital. Publikationerna kommer att följa Vancouvers riktlinjer.
14. Etik Biopsierna kommer att tas på dermatologiska avdelningen, Bispebjerg Universitetssjukhus. Personuppgifter och prover behandlas enligt personuppgifts- och hälsolagen. Projektet genomförs dessutom med minimala hälso- och säkerhetsrisker för deltagarna.

Kirurgiska ingrepp är dagliga händelser på sjukhus och kliniker över hela världen. Denna studie av NMSC-biomarkörer och utveckling av ny behandling av hudcancer baserad på masspektrometri har potential att minska tumörrecidiv, sjuklighet och kostnader. En studie av NMSC-biomarkörer och klinisk implementering av REIMS vid behandling av hudcancer har ännu inte utförts. Det förväntas att de potentiella riskerna för biverkningar i denna studie är små och att det finns en potentiell fördel med förbättring av tumörrecidiv, sjuklighet, kostnader, mindre arbetsintensiv och tidskrävande. Potentialen för evidensbaserade framtida vinster och de framtidsperspektiv som denna studie kan ge, bör hållas mot deltagarnas obehag under biopsi och extra besök på Bispebjerg Hospital. Danska lagar om patienträttigheter och ersättning kommer att följas.

15. Försäkring Bispebjerg Hospital

16. Referenser

1. Kost, kost, fysisk aktivitet och hudcancer. 2018.
2. Lamberg, A.L. et al. Den danska databasen för hudcancer hudcancer i Danmark. Clin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et al. Intag av alkohol kan modifiera risken för icke-melanom hudcancer: Resultat av en stor dansk prospektiv kohortstudie. J. Invest. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. Nya koncept för basalcellscancer. Demografiska, kliniska, histologiska riskfaktorer och biomarkörer. En systematisk genomgång av bevis avseende risk för tumörutveckling, känslighet för andra primära och återfall. J. Surg. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et al. Sjukdomskostnader för melanom och icke-melanom hudcancer i Danmark. Eur. J. Cancer Föreg. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, N.W.J. et al. Mohs mikrografiska kirurgi för behandling av basalcellscancer i ansiktet - Resultat av en retrospektiv studie och genomgång av litteraturen. Br. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et al. Masspektrometri avbildning i läkemedelsutveckling. Anal. Chem. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I.S. et al. Kombination av MALDI-MSI och kassettdosering för utvärdering av läkemedelsdistribution i human hudexplantat. Anal. Bioanal. Chem. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et al. Identifiering av biologiska vävnader genom snabb evaporativ joniseringsmasspektrometri. Anal. Chem. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et al. Intraoperativ vävnadsidentifiering med hjälp av snabb evaporativ joniseringsmasspektrometri. Sci. Transl. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. et al. Identifiering av ursprungsarterna för köttprodukter genom snabb evaporativ joniseringsmasspektrometri. J. Agric. Food Chem. 64, 4793-4800 (2016).