Huidtumorbiomarkers door massaspectrometriebeeldvorming

1. Titel Huidtumorbiomarkers door middel van massaspectrometrie

2. Doel 2.1 Probleemdefinitie Bij ruim 1 miljoen patiënten werd in 2018 wereldwijd de diagnose niet-melanoom huidkanker (NMSC) gesteld. Dit aantal zou onderschat kunnen worden vanwege het ontbreken van registers of onvolledige registratie van dit type kanker [1]. Tijdige detectie van microscopische tumoren is van het grootste belang bij de diagnostiek van kanker. Wij zijn van mening dat massaspectrometriebeeldvorming (MSI) met succes microscopische aggregaten van een veel voorkomende huidkanker, basaalcelcarcinoom (BCC) en plaveiselcelcarcinoom (SCC) kan lokaliseren en deze ex-vivo kan onderscheiden van aangrenzende normale huid. MSI onthult een veranderd chemisch profiel in de BCC- en SCC-regio (lipidepatronen) en vertrouwt niet op visuele identificatie van histopathologische kenmerken.

   2.2 Hypothese We veronderstellen dat NMSC-cellen specifieke, endogene biomarkers (lipidepatronen) vertonen die verschillen van gezond huidweefsel in secties van huidbiopten. Als deze hypothese klopt, zal het in de toekomst mogelijk zijn om real-time weefseldiagnose en behandeling van NMSC te ontwikkelen met behulp van massaspectrometriegeleide chirurgie.

   2.3 Uitkomstmaten

   • Identificatie van massa's en verdelingen van geselecteerde lipidenbiomarkers in secties van verwijderd BCC- en SCC-weefsel van Mohs-chirurgie.
   • Identificatie van massa's en verdelingen van geselecteerde lipidenbiomarkers in secties van biopsieën met actinische keratosen (pre-kwaadaardige laesies).

   2.4 Achtergrond De incidentie van niet-melanome huidkanker (NMSC) bedroeg in 2018 1 miljoen mensen, volgens het Skin Cancer Report van 2019 van het World Cancer Research Fund, en wordt geclassificeerd als de meest voorkomende kanker wereldwijd [1]. De NMSC omvat voornamelijk basaalcelcarcinoom (BCC) en plaveiselcelcarcinoom (SCC).

   In Denemarken en andere westerse landen is het voorkomen van deze tumoren ook hoog [2], en de Deense incidentie blijft stijgen, tot 15.000 per jaar. De belangrijkste risicofactor voor NMSC is blootstelling aan ultraviolette straling (UVR). Lichte huidskleur, licht of rood haar, lichte oogkleur en immuungecompromitteerde mensen zijn andere gevestigde oorzaken van NMSC [1,3].

   De Deense bevolking heeft een overwegend lichte huidskleur, is geografisch mobiel en houdt enorm van de zon, wat het risico op het ontwikkelen van huidkanker vergroot. Dagelijks ontvangen ongeveer 44 Denen een NMSC-diagnose, bestaande uit BCC of SCC, waarbij 40% in de daaropvolgende jaren nieuwe tumoren ontwikkelt. [4] NMSC heeft een lage mortaliteit, maar kent een opmerkelijke morbiditeit bij patiënten vanwege de hoge prevalentie en herhaling ervan [2], wat Denemarken jaarlijks meer dan 19 miljoen euro kost, wat hoger is dan de kosten van het gezondheidszorgbeheer en de gezondheidszorgkosten van melanoom [5]. De zorg voor NMSC wordt voornamelijk verzorgd door dermatologen, en bij de behandeling van NMSC kunnen meerdere modaliteiten worden gebruikt, zoals Mohs-micrografische chirurgie, excisie, cryotherapie en verschillende plaatselijke modaliteiten [2].

   De laagste recidiefpercentages van Mohs-micrografische chirurgie maken deze excisiechirurgie tot de eerste behandelingskeuze voor hoogrisico-NMSC [6]. Tijdens deze microscoopgeleide operatie wordt het weefsel uitgesneden, in stukken gesneden, gekleurd en beoordeeld door een getrainde patholoog. De patiënt wacht op de operatietafel terwijl de weefselranden worden geïnspecteerd op kankercellen, een bevinding die aanleiding geeft tot verdere weefselverwijdering uit het behandelingsgebied. Dienovereenkomstig is Mohs-chirurgie tijdrovend en duur, vanwege het beperkte aantal patiënten dat per dag kan worden behandeld en de behoefte aan hoogopgeleid laboratoriumpersoneel.

   Al tientallen jaren profiteren laboratoria van de indrukwekkende gevoeligheid en specificiteit van massaspectrometrie (MS). MS, een beproefde analytische techniek, ioniseert verbindingen en sorteert ze op basis van hun moleculaire massa. MS imaging (MSI) visualiseert de ruimtelijke verdeling van moleculen op een vergelijkbare manier. Het scannen van volledige weefselsecties (bijv. huid) en het genereren van een massaspectrum voor elke oppervlakte-eenheid, wordt een kaart van de weefselverdeling van een verbinding verschaft.

   MSI kan veel endogene moleculaire soorten tegelijkertijd detecteren, waaronder lipiden, kleine eiwitten en exogene farmaceutische geneesmiddelen die in zeer kleine concentraties in geanalyseerd weefsel worden gedistribueerd [8].

   Janfelt en collega's [10] konden onderscheid maken tussen epidermis en dermis met behulp van MSI op fosfolipiden. We zullen deze techniek gebruiken om endogene tumorbiomarkers te identificeren die aanwezig zijn in huidtumoren, maar niet aanwezig zijn (of in verschillende intensiteiten) in aangrenzende normale huid. MSI integreren in het diagnostische arsenaal voor NMSC, waarbij de technologie wordt gebruikt om in realtime specifieke membraanlipidensignaturen van kwaadaardig en goedaardig weefsel te differentiëren.

   Het langetermijndoel na dit project, als het mogelijk is om lipidenpatronen te identificeren die kwaadaardige en gezonde huid kunnen onderscheiden, is het introduceren van Rapid Evaporation Ionization Mass Spectrometry (REIMS), nu ook als iKnife [11]. Deze methode heeft het potentieel om veel gevoeliger te zijn door rechtstreeks chemische tumorsignaturen te identificeren in plaats van eenvoudige weefselanatomie, en is bovendien minder arbeidsintensief en tijdrovend. De REIMS-techniek bestaat uit een elektrochirurgisch handstuk dat is aangesloten op een massaspectrometer en in staat is om in realtime weefselidentificatie uit te voeren met behulp van het vernevelde weefsel dat tijdens elektrochirurgie wordt geproduceerd. Weefselidentificatie wordt bereikt door het automatisch matchen van massaspectra die tijdens de operatie zijn opgenomen, met een reeds bestaande "referentiebibliotheek". De modaliteit geeft de chirurg onmiddellijke informatie over welk type weefsel wordt gesneden, waardoor de behandeling wordt begeleid door de kankermarges met verbazingwekkende precisie af te bakenen. Lipidomische profielen lieten variatie zien tussen histologische tumortypen, waardoor weefsels konden worden onderscheiden door als biomarkers te fungeren [12]. REIMS is ook op andere gebieden effectief gebleken als een manier om de authenticiteit en kwaliteit van producten te bevestigen. In de voedingsindustrie wordt REIMS bijvoorbeeld gebruikt om in <3 seconden onderscheid te maken tussen rundvlees en paardenvlees, met een nauwkeurigheid van 100% [13].

3. Methode 3.1 Onderzoeksopzet voor patiënten met BCC en SCC's Wanneer patiënten worden doorverwezen voor een Mohs-chirurgische procedure bij de afdeling Dermatologie van het Bispebjerg-ziekenhuis, worden BCC's of SCC's verwijderd en wordt het weefsel ingebed, in stukken gesneden en gekleurd zodat de Mohs-chirurg kan beoordelen of er nog meer weefsel aanwezig is. het is nodig om verwijderd te worden. Drie huidsecties (5-10 µm dik) van dit weefsel dat al is verwijderd, zullen in ons onderzoek worden gebruikt. Eén sectie zal HE-gekleurd zijn, zodat we precies weten waar de interessante gebieden zich bevinden. Twee secties zullen worden gebruikt voor MS-analyse (MSI-spectrum en REIMS-spectrum).

   Momenteel voeren we Mohs-chirurgie uit op BCC's met een hoog risico op de afdeling Dermatologie van het Bispebjerg-ziekenhuis, maar Mohs-chirurgie van SCC's zal binnen een jaar worden opgenomen.

   3.2 Onderzoeksopzet voor patiënten met actinische keratosen Wanneer patiënten worden doorverwezen voor een procedure om meerdere actinische keratosen (graad 1, 2 of 3) te behandelen op de afdeling Dermatologie van het Bispebjerg-ziekenhuis, zullen we afhankelijk van de situatie een extra punchbiopsie (2-4 mm) nemen. op de grootte van de laesie. De biopsie wordt ingebed en in secties gesneden. We gebruiken 3 huidsecties (5-10 um dik). Eén sectie zal HE-gekleurd zijn, zodat we precies weten waar de interessante gebieden zich bevinden. Twee secties zullen worden gebruikt voor MS-analyse bij de afdeling Farmacie van de Universiteit van Kopenhagen. We zullen actinische keratosen van maximaal 100 patiënten opnemen.

   3.3 Weefselmicroarray De bovengenoemde coupes voor MSI zullen kennis opleveren over een enkele tumor in vergelijking met het aangrenzende normale weefsel. We moeten echter ook patiënten met elkaar vergelijken en daarom moeten we een weefselmicroarray maken.

   We zullen de weefselmicroarray maken van het verwijderde en ingebedde Aktinische keratosen/BCC/SCC-weefsel. Eén sectie zal door MSI worden geanalyseerd met dezelfde procedure als hierboven beschreven en extra secties zullen met HE worden gekleurd voor pathologische evaluatie en traditionele immunohistochemische markers zoals Ki67 en p53.

4. Statistische berekeningen Multivariate statistische analyse zal worden uitgevoerd op alle massaspectra met behulp van Matlab of een soortgelijk programma. Lineaire discriminantanalyse zal worden gebruikt om spectrale verschillen tussen pre-kwaadaardig, kanker- en normaal weefsel te identificeren. De classificatieprestaties worden geregistreerd met een kruisvalidatieschema dat één patiënt eruit laat. Het aantal monsters is gebaseerd op de berekening van de steekproefomvang en eerdere publicaties over andere kankervormen en wordt geschat voldoende te zijn om een ​​referentiebibliotheek te genereren. We plannen een onderzoek naar een continue responsvariabele van gematchte paren van proefpersonen. Eerdere gegevens geven aan dat het verschil in de respons van gematchte paren normaal verdeeld is met een standaarddeviatie van 8. Als het werkelijke verschil in de gemiddelde respons van gematchte paren 3 is, zullen we 58 paren proefpersonen moeten bestuderen om de nulhypothese te kunnen verwerpen dat dit responsverschil nul is met een waarschijnlijkheid (power) van 0,8. De kans op een Type I-fout die bij deze toetsing van deze nulhypothese hoort, bedraagt ​​0,05. (geprogrammeerd gebruikt voor berekening van de steekproefgrootte; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versie 3.1.2). Op basis van deze berekeningen zullen we tussen de 60 en 100 patiënten met BCC's, AK's en SCC's rekruteren. Er zijn minimaal 180 patiënten en maximaal 300 patiënten.

5. Deelnemers In totaal zullen maximaal 300 patiënten worden gerekruteerd om aan het onderzoek deel te nemen. Mannen en vrouwen van 18 jaar of ouder die voldoen aan de in- en exclusiecriteria worden opgenomen. Alle potentiële patiënten zullen worden gerekruteerd bij de afdeling Dermatologie van het Bispebjerg Universitair Ziekenhuis.

   Geïnteresseerde patiënten zullen worden uitgenodigd voor een voorbereidend informatiescreeningsbezoek, waarbij zij uitgebreide mondelinge informatie over het onderzoek zullen ontvangen van de hoofdonderzoeker, Catharina Lerche, Mohs-chirurg Martin Gluud of projectverpleegkundige June Svendsen, en schriftelijke informatie zal worden uitgedeeld. De bijeenkomst zal plaatsvinden in een apart kantoor om een ​​veilige en rustige omgeving te garanderen. De patiënten worden er specifiek op gewezen dat zij desgewenst één of meerdere beoordelaars kunnen meenemen naar alle bijeenkomsten en interventies. Schriftelijke geïnformeerde toestemming wordt verkregen bij opname op de dag van de chirurgische ingreep, die ten minste 24 uur na het screeningsbezoek zal plaatsvinden.

   Elke patiënt wordt door de onderzoeker beoordeeld om te beoordelen of hij of zij geschikt is om aan het onderzoek deel te nemen. Om een ​​homogene groep optische vergelijkingen te garanderen, zal de rekrutering worden uitgevoerd op basis van de volgende criteria:

   5.1 Inclusiecriteria • Patiënten ouder dan 18 jaar.

   • Patiënten die zich presenteren met AK's, SCC's en BCC's.

   • Schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van de patiënt.

   5.2 Uitsluitingscriteria • Patiënten met immunosuppressie

6. Mogelijke risico's en bijwerkingen Alle patiënten worden zowel mondeling als schriftelijk geïnformeerd over de risico's en mogelijke bijwerkingen.

   6.1 Punchbiopsie Voor patiënten met BCC en SCC gebruiken we alleen weefsel dat al is verwijderd via de standaard Mohs-procedure. Bij patiënten met actinische keratosen wordt een biopsie uitgevoerd onder plaatselijke verdoving, met een diameter van 2, 3 of 4 mm en een diepte van 3 mm. Elke biopsie laat een rond litteken achter met een diameter van 2 mm of 4 mm, dat binnen 2 weken oploopt. Injectie van lokale anesthesie kan pijn en een tintelend/prikkelend gevoel op de injectieplaats veroorzaken. Er is een minimale kans op infectie, maar als deze zich toch voordoet zullen wij deze behandelen.

7. Biobank Er zal een onderzoeksbiobank worden opgericht overeenkomstig de commissiewet §2 nr. 13. Alle mogelijke biopsieën/secties worden bewaard in een afgesloten vriezer van -80 °C bij de afdeling Dermatologie, Bispebjerg Universitair Ziekenhuis tot analyse bij de Afdeling Farmacie, Universiteit van Kopenhagen, Universitetsparken 2, 2100 Kopenhagen Ø. We kunnen de analyse niet altijd binnen 5-7 dagen uitvoeren, omdat het tot 20 uur duurt om één MSI-foto te maken en als we meerdere BCC/SCC/Actinische keratose-patiënten op één dag hebben, zal er een vertraging optreden. Bij het maken van de weefselmicroarray verzamelen we vóór analyse weefsel van 6-8 patiënten. Na MSI-analyse worden de monsters vernietigd. De vernietiging van de resterende delen van biopsieblokken en weefselmicroarrayblokken zal niet later zijn dan 1. Januari 2025. Er wordt geen weefsel bewaard voor niet-specifiek onderzoek.
8. Informatie uit patiëntendagboeken Zorgpersoneel zal informatie over de pathologische beschrijving van de vermoedelijke laesie uit het patiëntendagboek gebruiken bij het screenen van mogelijke patiënten die in dit onderzoek worden opgenomen. Nadat de geïnformeerde toestemming door de patiënt is ondertekend, zal informatie uit het patiëntendagboek met betrekking tot de beschrijving van het tumortype, de locatie, de grootte en of het een terugkerende laesie betreft, worden gebruikt.

9. Gegevensbescherming, informatieopslag en kwaliteitscontrole 9.1 Kwaliteitscontrole De verklaring van Helsinki II zal worden gerespecteerd, evenals de normen van goed klinisch onderzoek. Het respect voor de privacy en de fysieke en mentale integriteit van patiënten zal worden gehandhaafd. Het onderzoek zal worden geregistreerd bij de Commissie voor Gezondheidsonderzoek Ethiek en de Deense gegevensbeschermingsautoriteit.

   9.2 Gegevensbescherming en opslag De Algemene Verordening Gegevensbescherming (Deens: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) zal worden gerespecteerd. Onderzoek waarbij gebruik wordt gemaakt van de gegevens van het Hoofdstedelijk Gewest van Denemarken wordt beschouwd als openbaar onderzoek. Het gebruik en de distributie van de in dit onderzoek verzamelde gegevens zullen tijdens het toestemmingsproces met patiënten worden besproken. Het project zal worden gerapporteerd aan het Deense Kenniscentrum voor de naleving van gegevensbescherming (Deens: Videncenter voor Dataanmeldelse, Regio Hovedstaden). Er zal een lijst van gescreende patiënten en patiënten worden opgesteld, inclusief namen, studie-ID-nummer en geboortedatum. Alle verzamelde gegevens worden geanonimiseerd en beschermd door de Deense wet met betrekking tot het beheer van persoonlijke informatie en de Deense gezondheidswet (Deens: Sundhedsloven). Gegevens worden geregistreerd en bewaard gedurende 5 jaar na beëindiging van het onderzoek op de dermatologische afdeling van het Bispebjerg-ziekenhuis.

10. Financiële overwegingen Het onderzoek is opgezet door hoofdonderzoeker Catharina M. Lerche. Er is geen financiële steun bedacht door commerciële bedrijven. De afdeling Dermatologie van het Bispebjerg Universitair Ziekenhuis zal het salaris van de hoofdonderzoeker Catharina M Lerche verstrekken. Andere uitgaven in verband met het project worden gedekt door de Deense Kankervereniging (Knæk Cancer midler 1,6 miljoen DKK) en de Lundbeck Foundation (10 miljoen DKK). Hoofdonderzoeker Catharina M. Lerche en de medewerkers hebben geen enkele persoonlijke relatie of economisch belang in de Deense Kankervereniging of de Lundbeck Foundation.
11. Vergoedingen Er vindt geen vergoeding plaats aan de patiënten.

12. Informatie aan patiënten De hoofdonderzoeker, Catharina M. Lerche, is verantwoordelijk voor het geven van duidelijke mondelinge en schriftelijke informatie over het doel, de opzet en de risico's van het onderzoek, zoals vermeld in "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" van het Deense Ministerie van Volksgezondheid ( Deens: Sundheds- og Ældreministeriet). In een ongestoorde setting wordt de deelnemer gewezen op zijn recht op aanwezigheid van een/of meer beoordelaar(s), dat de deelnemer vrijwillig is en dat terugtrekking op ieder moment tijdens het onderzoek mogelijk is. Patiënten krijgen voldoende bedenktijd (minimaal 24 uur). Patiënten wordt gevraagd een toestemmingsformulier te ondertekenen.

    De patiënt zal worden verzocht het bijgevoegde materiaal rechts van de onderzoeksdeelnemer te lezen. Er wordt geen onderzoeksprocedure gestart voordat de deelnemer de geïnformeerde toestemming heeft ondertekend. Bijkomende vragen van patiënten worden beantwoord door de contactpersoon, Catharina M. Lerche

13. Publicatie van resultaten Positieve, negatieve en onduidelijke resultaten worden gepubliceerd. Het doel is om de resultaten te publiceren en te presenteren in een peer-reviewed internationaal dermatologietijdschrift en/en op dermatologische conferenties. De intellectuele eigendomsrechten op de resultaten behoren toe aan het Bispebjerg Universitair Ziekenhuis. Publicaties zullen in overeenstemming zijn met de Vancouver-richtlijnen.
14. Ethiek De biopsieën zullen worden afgenomen bij de afdeling Dermatologie van het Bispebjerg Universitair Ziekenhuis. Persoonsgegevens en monsters vallen onder de Wet Persoonsgegevens en Gezondheid. Het project wordt bovendien uitgevoerd met minimale gezondheids- en veiligheidsrisico's voor de deelnemers.

Chirurgische ingrepen zijn dagelijkse gebeurtenissen in ziekenhuizen en klinieken over de hele wereld. Deze studie van NMSC-biomarkers en de ontwikkeling van een nieuwe behandeling van huidkanker op basis van massaspectrometrie heeft het potentieel om tumorherhaling, morbiditeit en kosten te verminderen. Een onderzoek naar NMSC-biomarkers en klinische implementatie van REIMS bij de behandeling van huidkanker is nog niet uitgevoerd. Er wordt verwacht dat de potentiële risico's op bijwerkingen in deze studie klein zijn en dat er een potentieel voordeel is van verbetering van het terugkeren van de tumor, morbiditeit en kosten, die minder arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Het potentieel van op bewijs gebaseerde toekomstige winsten en de toekomstperspectieven die deze studie kan bieden, moeten worden afgewogen tegen het ongemak van de deelnemers tijdens de biopsie en het extra bezoek aan het Bispebjerg-ziekenhuis. De Deense wetten met betrekking tot de rechten van patiënten en compensatie zullen worden gevolgd.

15. Verzekering Bispebjerg-ziekenhuis

16. Referenties

1. Dieet, voeding, fysieke activiteit en huidkanker. 2018.
2. Lamberg, A.L. et al. De Deense niet-melanoom dermatologische database voor huidkanker. Klin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et al. Inname van alcohol kan het risico op niet-melanome huidkanker wijzigen: resultaten van een groot Deens prospectief cohortonderzoek. J. Investeren. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T.G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. Nieuwe concepten voor basaalcelcarcinoom. Demografische, klinische, histologische risicofactoren en biomarkers. Een systematische review van bewijsmateriaal met betrekking tot het risico op tumorontwikkeling, gevoeligheid voor tweede primaire en recidief. J. Surg. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et al. Ziektekosten voor melanoom en niet-melanoom huidkanker in Denemarken. EUR. J. Kanker Vorige. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, N.W.J. et al. Mohs' micrografische chirurgie voor de behandeling van basaalcelcarcinoom van het gezicht - Resultaten van een retrospectief onderzoek en literatuuroverzicht. Br. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et al. Massaspectrometriebeeldvorming bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. Anaal. Chem. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I.S. et al. Combinatie van MALDI-MSI en cassettedosering voor evaluatie van de distributie van geneesmiddelen bij menselijke huidexplantatie. Anaal. Bioanaal. Chem. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et al. Identificatie van biologische weefsels door snelle verdampingionisatie-massaspectrometrie. Anaal. Chem. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et al. Intraoperatieve weefselidentificatie met behulp van snelle verdampingsionisatie-massaspectrometrie. Wetenschap Vert. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. et al. Identificatie van de oorsprongssoort van vleesproducten door massaspectrometrie door snelle verdampingionisatie. J. Agric. Voedsel Chem. 64, 4793-4800 (2016).