Биомаркеры опухолей кожи с помощью масс-спектрометрической визуализации

1. Название Биомаркеры опухолей кожи, полученные методом масс-спектрометрии

2. Цель 2.1. Постановка проблемы. В 2018 году во всем мире немеланомный рак кожи (НМРК) был диагностирован более чем у 1 миллиона пациентов, и это число могло быть занижено из-за отсутствия реестров или неполной регистрации этого типа рака [1]. Своевременное выявление микроскопических опухолей имеет первостепенное значение в диагностике рака. Мы полагаем, что масс-спектрометрическая визуализация (MSI) может успешно обнаруживать микроскопические агрегаты обычного рака кожи, базальноклеточного рака (BCC) и плоскоклеточного рака (SCC) и отличать их от прилегающей нормальной кожи ex vivo. MSI обнаруживает измененный химический профиль в области BCC и SCC (липидный профиль) и не полагается на визуальную идентификацию гистопатологических особенностей.

   2.2 Гипотеза Мы предполагаем, что клетки НМСК обладают специфическими эндогенными биомаркерами (липидными структурами), которые отличаются от здоровой кожной ткани в срезах биопсии кожи. Если эта гипотеза верна, в будущем станет возможным разработать диагностику тканей и лечение НМРК в реальном времени с использованием хирургии под контролем масс-спектрометрии.

   2.3 Оценка результатов

   • Идентификация масс и распределения выбранных липидных биомаркеров в срезах тканей ОЦК и ПКК, удаленных после операции Мооса.
   • Идентификация масс и распределения выбранных липидных биомаркеров в срезах биоптатов с актиническим кератозом (предраковыми поражениями).

   2.4 Общие сведения Согласно отчету Всемирного фонда исследования рака за 2019 год, заболеваемость немеланомным раком кожи (НМРК) составила 1 миллион человек в 2018 году и классифицируется как наиболее распространенный рак во всем мире [1]. НМСК поражает преимущественно базальноклеточный рак (БКК) и плоскоклеточный рак (ПКР).

   В Дании и других западных странах частота возникновения этих опухолей также высока [2], а заболеваемость в Дании продолжает расти, составляя 15 000 в год. Основным фактором риска НМРК является воздействие ультрафиолетового излучения (УФИ). Светлый цвет кожи, светлые или рыжие волосы, светлый цвет глаз и люди с ослабленным иммунитетом являются другими установленными причинами НМРК [1,3].

   Население Дании преимущественно светлокожее, географически мобильное и чрезвычайно солнцелюбивое, что повышает риск развития рака кожи. Ежедневно ~ 44 датчанина получают диагноз НМРК, состоящий либо из БКК, либо из ПКР, при этом у 40% в последующие годы развиваются новые опухоли [4] НМРК имеет низкую смертность, однако имеет заметную заболеваемость пациентов из-за высокой распространенности и рецидивов. [2], что обходится Дании более чем в 19 миллионов евро в год, что превышает затраты на управление здравоохранением и расходы на здравоохранение при меланоме [5]. Уход за НМРК осуществляется в основном дерматологами, и при лечении НМРК могут использоваться различные методы, такие как микрографическая хирургия по Моосу, иссечение, криотерапия и различные местные методы [2].

   Самая низкая частота рецидивов микрографической хирургии по Моосу делает эту эксцизионную операцию первым выбором для лечения НМРК высокого риска [6]. Во время этой операции под контролем микроскопа ткань иссекается, разрезается, окрашивается и оценивается опытным патологом. Пациент ждет на операционном столе, пока края тканей проверяются на наличие раковых клеток, что требует дальнейшего удаления тканей из области лечения. Соответственно, операция по Моосу требует много времени и денег из-за ограниченного числа пациентов, которых можно лечить в день, и необходимости в высококвалифицированном лабораторном персонале.

   На протяжении десятилетий лаборатории пользовались впечатляющей чувствительностью и специфичностью масс-спектрометрии (МС). Хорошо зарекомендовавший себя аналитический метод МС ионизирует соединения и сортирует их по молекулярной массе. МС-визуализация (MSI) аналогичным образом визуализирует пространственное распределение молекул. Сканирование целых срезов ткани (например, кожа) и создания масс-спектра для каждой единицы площади предоставляется карта распределения соединения в тканях.

   MSI может одновременно обнаруживать множество эндогенных молекулярных видов, включая липиды, небольшие белки, а также экзогенные фармацевтические препараты, распределенные в минимальных концентрациях в анализируемой ткани [8].

   Янфельт и его коллеги [10] смогли отличить эпидермис от дермы, используя MSI на фосфолипидах. Мы будем использовать этот метод для выявления эндогенных опухолевых биомаркеров, присутствующих в опухолях кожи, но не присутствующих (или в различной интенсивности) в прилегающей нормальной коже. Интеграция MSI в диагностический арсенал НМСК с использованием технологии для дифференциации в режиме реального времени специфических показателей мембранных липидов злокачественных и доброкачественных тканей.

   Долгосрочная цель этого проекта, если будет возможно идентифицировать липидные структуры, способные отличить злокачественную и здоровую кожу, состоит в том, чтобы внедрить масс-спектрометрию с ионизацией быстрого испарения (REIMS), также теперь как iKnife [11]. Этот метод потенциально может быть гораздо более чувствительным за счет непосредственного выявления химических признаков опухоли, а не простой анатомии ткани, а также быть менее трудоемким и отнимать много времени. Методика REIMS состоит из электрохирургического наконечника, соединенного с масс-спектрометром, способного выполнять идентификацию тканей в режиме реального времени с использованием аэрозольной ткани, полученной во время электрохирургии. Идентификация тканей достигается путем автоматического сопоставления масс-спектров, записанных во время операции, с уже существующей «справочной библиотекой». Этот метод предоставляет хирургу немедленную информацию о том, какой тип ткани разрезается, и направляет лечение, очерчивая границы рака с поразительной точностью. Липидомные профили показали различия между гистологическими типами опухолей, что позволяет различать ткани, выступая в качестве биомаркеров [12]. REIMS также доказал свою эффективность в других областях как способ подтверждения подлинности и качества продукции. Так, в пищевой промышленности REIMS используется для различения говядины и конины менее чем за 3 секунды с точностью 100 % [13].

3. Метод 3.1. Дизайн исследования для пациентов с ОЦК и ПКР. Когда пациентов направляют на хирургическую процедуру Мооса в отделение дерматологии больницы Биспебьерг, ОЦК или ПКК удаляют, а ткань встраивают, разрезают и окрашивают, чтобы хирург Мооса мог оценить, есть ли еще ткани. необходимо удалить. В нашем исследовании будут использованы три участка кожи (толщиной 5-10 мкм) этой уже удаленной ткани. Один срез будет окрашен HE, чтобы мы точно знали, где находятся интересующие области. Для МС-анализа будут использоваться две секции (спектр MSI и спектр REIMS).

   В настоящее время мы проводим операцию Мооса на ОЦК высокого риска в отделении дерматологии больницы Биспебьерг, но хирургия Мооса ПКР будет включена в течение года.

   3.2 Дизайн исследования для пациентов с актиническим кератозом Когда пациенты направляются на процедуру для лечения нескольких актинических кератозов (1, 2 или 3 степени) в отделении дерматологии больницы Биспебьерг, мы возьмем дополнительную пункционную биопсию (2-4 мм) в зависимости от от размера поражения. Биопсия встраивается и секционируется. Мы будем использовать 3 участка кожи (толщиной 5-10 мкм). Один срез будет окрашен HE, чтобы мы точно знали, где находятся интересующие области. Два раздела будут использоваться для анализа МС на фармацевтическом факультете Копенгагенского университета. Мы включим актинический кератоз от 100 пациентов.

   3.3 Тканевый микрочип Вышеупомянутые срезы для MSI дадут информацию об одной опухоли в сравнении с прилегающей нормальной тканью. Однако нам также необходимо сравнивать пациентов друг с другом, и поэтому нам нужно составить тканевый микрочип.

   Мы создадим тканевый микрочип из удаленной и встроенной ткани актинического кератоза / ОЦК / ПКР. Один срез будет проанализирован с помощью MSI с использованием той же процедуры, что описана выше, а дополнительные срезы будут окрашены HE для оценки патологии и традиционных иммуногистохимических маркеров, таких как Ki67 и p53.

4. Статистические расчеты. Многомерный статистический анализ будет выполняться для всех масс-спектров с использованием Matlab или аналогичной программы. Линейный дискриминантный анализ будет использоваться для выявления спектральных различий между предраковыми, раковыми и нормальными тканями. Эффективность классификации будет регистрироваться с использованием схемы перекрестной проверки «отпустить одного пациента». Количество образцов основано на расчете размера выборки и предыдущих публикациях о других формах рака и оценивается как достаточное для создания справочной библиотеки. Мы планируем исследование переменной непрерывного ответа от подобранных пар субъектов исследования. Предыдущие данные показывают, что разница в ответах совпадающих пар обычно распределяется со стандартным отклонением 8. Если истинная разница в среднем ответе сопоставленных пар равна 3, нам нужно будет изучить 58 пар испытуемых, чтобы иметь возможность отвергнуть нулевую гипотезу о том, что эта разница ответов равна нулю с вероятностью (степенью) 0,8. Вероятность ошибки типа I, связанная с этой проверкой нулевой гипотезы, равна 0,05. (программа, используемая для расчета размера выборки; Расчет мощности и размера выборки, PS, Университет Вандербильта; версия 3.1.2). На основе этих расчетов мы наберем от 60 до 100 пациентов с ОЦК, АК и плоскоклеточным раком. Минимум будет 180 пациентов, максимум 300 пациентов.

5. Участники Всего для участия в исследовании будут привлечены максимум 300 пациентов. Включены мужчины и женщины в возрасте 18 лет и старше, соответствующие критериям включения и исключения. Все потенциальные пациенты будут набраны из отделения дерматологии университетской больницы Биспебьерг.

   Заинтересованные пациенты будут приглашены на предварительный визит для проверки информации, во время которого они получат исчерпывающую устную информацию об исследовании от главного исследователя Катарины Лерш, хирурга Мооса Мартина Глууда или медсестры проекта Джун Свендсен, а также будет роздана письменная информация. Встреча пройдет в отдельном офисе, чтобы обеспечить безопасную и спокойную обстановку. Пациентов специально информируют о том, что они могут приглашать одного или нескольких экспертов на все встречи и мероприятия, если они того пожелают. Письменное информированное согласие будет получено при включении в день хирургической процедуры, которая состоится не менее чем через 24 часа после скринингового визита.

   Каждый пациент будет оценен исследователем для оценки пригодности участия в исследовании. Для обеспечения однородности группы оптического сравнения набор будет осуществляться по следующим критериям:

   5.1 Критерии включения • Пациенты старше 18 лет.

   • Пациенты с АК, плоскоклеточным раком и базальноклеточным раком.

   • Письменное информированное согласие, полученное от пациента.

   5.2 Критерии исключения • Пациенты с иммуносупрессией

6. Потенциальный риск и побочные эффекты Все пациенты будут проинформированы устно и письменно о рисках и возможных побочных эффектах.

   6.1. Пункционная биопсия. Для пациентов с базальноклеточным раком и плоскоклеточным раком мы будем использовать только ткани, уже удаленные с помощью стандартной процедуры Мооса. У пациентов с актиническим кератозом под местной анестезией берут биопсию диаметром 2, 3 или 4 мм и глубиной 3 мм. Каждая биопсия оставляет круглый рубец диаметром 2 или 4 мм, который увеличивается в течение 2 недель. Введение местной анестезии может вызвать боль и ощущение покалывания/покалывания в месте инъекции. Вероятность заражения минимальна, но если она произойдет, мы ее вылечим.

7. Биобанк. Исследовательский биобанк будет создан в соответствии с законом о комитете §2 nr. 13. Все потенциальные биопсии/срезы будут храниться в закрытой морозильной камере с температурой -80°C в отделении дерматологии университетской больницы Биспебьерг до анализа в фармацевтическом отделении Копенгагенского университета, Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen Ø. Мы не всегда можем сделать анализ в течение 5-7 дней, поскольку на получение одной фотографии MSI уходит до 20 часов, а если у нас будет несколько пациентов с ОЦК/SCC/актиническим кератозом в один день, то будет задержка. При создании тканевого микрочипа перед анализом мы собираем ткани от 6-8 пациентов. После анализа MSI образцы будут уничтожены. Разрушение оставшихся частей блоков биопсии и блоков тканевых микрочипов будет не позднее 1. Январь 2025 г. Ни одна ткань не будет сохранена для неспецифического исследования.
8. Информация из журналов пациентов Медицинский персонал будет использовать информацию об описании патологии предполагаемого поражения из журнала пациентов при отборе возможных пациентов для включения в это исследование. После подписания пациентом информированного согласия будет использоваться информация из журнала пациента, касающаяся описания типа опухоли, ее местоположения, размера и того, является ли она рецидивирующим поражением.

9. Защита данных, хранение информации и контроль качества 9.1 Контроль качества Будет соблюдаться Хельсинкская декларация II, а также стандарты хороших клинических исследований. Будет обеспечено уважение неприкосновенности частной жизни, а также физическая и психическая неприкосновенность пациентов. Исследование будет зарегистрировано в Комитете по этике медицинских исследований и в Датском агентстве по защите данных.

   9.2 Защита и хранение данных Общие правила защиты данных (датский: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) будут соблюдаться. Исследование с использованием данных столичного региона Дании считается публичным исследованием. Использование и распространение данных, собранных в этом исследовании, будут обсуждаться с пациентами в процессе получения согласия. Информация о проекте будет передана в Датский центр знаний по соблюдению требований по защите данных (датский: Videncenter for Dataanmeldelse, регион Ховедстаден). Будет составлен список прошедших обследование и пациентов, включая имена, идентификационный номер исследования и дату рождения. Все собранные данные будут анонимизированы и защищены датским законодательством об управлении личной информацией и датским Законом о здравоохранении (датский: Sundhedsloven). Данные будут зарегистрированы и сохранены в течение 5 лет после завершения исследования в дерматологическом отделении больницы Биспебьерг.

10. Финансовые соображения. Исследование задумано главным исследователем Катариной М. Лерш. Никакой финансовой поддержки со стороны коммерческих компаний не было. Отделение дерматологии университетской больницы Биспебьерг обеспечит зарплату главному исследователю Катарине М. Лерче. Другие расходы, связанные с проектом, покрываются Датским онкологическим обществом (Knæk Cancer Midler, 1,6 млн датских крон) и Фондом Лундбека (10 млн датских крон). Главный исследователь Катарина М. Лерш и сотрудники не имеют никаких личных связей или экономической заинтересованности в Датском онкологическом обществе или Фонде Лундбека.
11. Возмещение расходов Пациентам возмещение не производится.

12. Информация для пациентов Главный исследователь, Катарина М. Лерш, несет ответственность за предоставление четкой устной и письменной информации о цели, дизайне и рисках исследования, как указано в «Информации и рекомендации по дельтагельсе I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter» Министерства здравоохранения Дании ( Датский: Sundheds- og Ældreministeriet). В спокойной обстановке участник будет проинформирован о своем праве на присутствие одного/или нескольких экспертов, этот участник является добровольным и что отказ от участия возможен в любой момент во время исследования. Пациентам будет предоставлено достаточное время для рассмотрения (минимум 24 часа). Пациентам будет предложено подписать форму согласия.

    Пациенту будет предложено прочитать прилагаемый материал по праву участника исследования. Никакие процедуры исследования не будут начаты до тех пор, пока участники не подпишут информированное согласие. На дополнительные вопросы пациентов ответит контактное лицо Катарина М. Лерш.

13. Публикация результатов. Положительные, отрицательные и неубедительные результаты будут опубликованы. Целью является публикация и представление результатов в рецензируемом международном дерматологическом журнале или/или на дерматологических конференциях. Права интеллектуальной собственности на результаты принадлежат Университетской больнице Биспебьерг. Публикации будут соответствовать Ванкуверским правилам.
14. Этика Биопсии будут взяты в отделении дерматологии Университетской больницы Биспебьерга. Личная информация и образцы обрабатываются в соответствии с Законом о персональных данных и здравоохранении. Кроме того, проект осуществляется с минимальными рисками для здоровья и безопасности участников.

Хирургические процедуры – это ежедневные мероприятия в больницах и клиниках по всему миру. Это исследование биомаркеров НМСК и разработка нового метода лечения рака кожи на основе масс-спектрометрии потенциально могут снизить рецидивы опухолей, заболеваемость и затраты. Исследование биомаркеров НМСК и клиническое применение REIMS в лечении рака кожи пока не проводилось. Ожидается, что потенциальные риски побочных эффектов в этом исследовании невелики и что существует потенциальная польза от снижения рецидивов опухоли, заболеваемости, затрат, меньшей трудоемкости и времени. Потенциал будущих достижений, основанных на фактических данных, и будущие перспективы, которые может обеспечить это исследование, следует учитывать с учетом дискомфорта участников во время биопсии и дополнительного посещения больницы Биспебьерг. Будут соблюдаться датские законы, касающиеся прав пациентов и компенсаций.

15. Страховая больница Биспебьерг

16. Ссылки

1. Диета, питание, физическая активность и рак кожи. 2018.
2. Ламберг, А.Л. и др. Датская дерматологическая база данных немеланомного рака кожи. Клин. Эпидемиол. 8, 633-636 (2016).
3. Дженсен А. и др. Употребление алкоголя может изменить риск немеланомного рака кожи: результаты большого проспективного когортного исследования в Дании. Дж. Инвест. Дерматол. 132, 2718-2726 (2012).
4. Киргидис А., Целлос Т.Г., Вахцеванос К. и Триаридис С. Новые концепции базальноклеточной карциномы. Демографические, клинические, гистологические факторы риска и биомаркеры. Систематический обзор данных о риске развития опухоли, предрасположенности к вторичной первичной опухоли и рецидиву. Дж. Сург. Рез. 159, 545–556 (2010).
5. Бентцен Дж. и др. Стоимость лечения меланомы и немеланомного рака кожи в Дании. Евро. Дж. Рак Пред. 22, 569–576 (2013).
6. Смитс, N.W.J. и др. Микрографическая хирургия Мооса в лечении базальноклеточного рака лица - Результаты ретроспективного исследования и обзора литературы. Бр. Дж. Дерматол. 151, 141–147 (2004).

8. Нильссон А. и др. Масс-спектрометрическая визуализация при разработке лекарств. Анальный. хим. 87, 1437–1455 (2015).

10. Соренсен И.С. и др. Комбинация MALDI-MSI и кассетного дозирования для оценки распределения лекарственного средства в эксплантате кожи человека. Анальный. Биоанал. хим. 409, 4993-5005 (2017).

11. Балог Дж. и др. Идентификация биологических тканей методом быстрой испарительно-ионизационной масс-спектрометрии. Анальный. хим. 82, 7343-7350 (2010).

12. Балог Дж. и др. Интраоперационная идентификация тканей с использованием масс-спектрометрии с быстрой испарительной ионизацией. наук. Перевод Мед. 5, (2013).

13. Балог Дж. и др. Идентификация видов происхождения мясных продуктов методом быстрой испарительно-ионизационной масс-спектрометрии. Дж. Агрик. Пищевая хим. 64, 4793-4800 (2016).