Biomarcadores de tumores cutáneos mediante imágenes de espectrometría de masas

1. Título Biomarcadores de tumores cutáneos mediante espectrometría de masas

2. Objetivo 2.1 Definición del problema Más de 1 millón de pacientes fueron diagnosticados con cáncer de piel no melanoma (NMSC) en todo el mundo en 2018 y este número podría subestimarse debido a la falta de registros o al registro incompleto de este tipo de cáncer [1]. La detección oportuna de tumores microscópicos es de suma importancia en el diagnóstico del cáncer. Creemos que las imágenes de espectrometría de masas (MSI) pueden localizar con éxito agregados microscópicos de un cáncer de piel común, el carcinoma de células basales (BCC) y el carcinoma de células escamosas (SCC), y distinguirlos de la piel normal adyacente ex vivo. MSI revela un perfil químico alterado en la región BCC y SCC (patrones lipídicos) y no se basa en la identificación visual de características histopatológicas.

   2.2 Hipótesis Nuestra hipótesis es que las células NMSC exhiben biomarcadores endógenos específicos (patrones de lípidos) que difieren del tejido cutáneo sano en secciones de biopsias de piel. Si esa hipótesis es correcta, en el futuro será posible desarrollar el diagnóstico y el tratamiento de tejidos en tiempo real del NMSC mediante cirugía guiada por espectrometría de masas.

   2.3 Medidas de resultado

   • Identificación de masas y distribuciones de biomarcadores lipídicos seleccionados en secciones de tejido BCC y SCC extirpado de la cirugía de Mohs.
   • Identificación de masas y distribuciones de biomarcadores lipídicos seleccionados en cortes de biopsias con queratosis actínicas (lesiones premalignas).

   2.4 Antecedentes La incidencia de cáncer de piel no melanoma (NMSC) fue de 1 millón de personas en 2018, según el Informe sobre el cáncer de piel de 2019 del Fondo Mundial de Investigación del Cáncer, clasificándose como el cáncer que ocurre con más frecuencia en todo el mundo [1]. El NMSC engloba principalmente el carcinoma de células basales (BCC) y el carcinoma de células escamosas (SCC).

   En Dinamarca y otros países occidentales la aparición de estos tumores también es alta [2], y la incidencia danesa sigue aumentando, ascendiendo a 15.000 por año. El principal factor de riesgo del NMSC es la exposición a la radiación ultravioleta (UVR). El color de piel claro, el cabello claro o pelirrojo, el color de ojos claro y las personas inmunodeprimidas son otras causas establecidas del NMSC [1,3].

   La población danesa es predominantemente de piel clara, geográficamente móvil y extremadamente amante del sol, lo que aumenta el riesgo de desarrollar cáncer de piel. Diariamente, ~44 daneses reciben un diagnóstico de NMSC, que consiste en BCC o SCC, y el 40% desarrolla nuevos tumores en los años siguientes [4] El NMSC tiene una mortalidad baja, sin embargo, tiene una morbilidad notable para los pacientes debido a su alta prevalencia y recurrencia. [2], con un coste de más de 19 millones de euros al año para Dinamarca, superando el coste de la gestión sanitaria y los costes de atención sanitaria del melanoma [5]. La atención del NMSC la realizan principalmente dermatólogos, y se pueden utilizar múltiples modalidades en el tratamiento del NMSC, como la cirugía micrográfica de Mohs, la escisión, la crioterapia y diferentes modalidades tópicas [2].

   Las tasas de recurrencia más bajas de la cirugía micrográfica de Mohs hacen de esta cirugía de escisión la primera opción de tratamiento para el NMSC de alto riesgo [6]. Durante esta cirugía guiada por microscopio, un patólogo capacitado extirpa, secciona, tiñe y evalúa el tejido. El paciente espera en la mesa de operaciones mientras se inspeccionan los márgenes del tejido en busca de células cancerosas, un hallazgo que provoca una mayor extracción de tejido del área de tratamiento. En consecuencia, la cirugía de Mohs requiere mucho tiempo y es costosa, debido al número limitado de pacientes que pueden tratarse por día y a la necesidad de personal de laboratorio altamente capacitado.

   Durante décadas, los laboratorios se han beneficiado de la impresionante sensibilidad y especificidad de la espectrometría de masas (EM). La MS, una técnica analítica bien establecida, ioniza compuestos y los clasifica según su masa molecular. Las imágenes por EM (MSI) visualizan la distribución espacial de las moléculas de manera similar. Escanear secciones de tejido completo (p. ej. piel) y generando un espectro de masas para cada unidad de área, se proporciona un mapa de la distribución tisular de un compuesto.

   MSI puede detectar muchas especies moleculares endógenas simultáneamente, incluidos lípidos, proteínas pequeñas y fármacos exógenos distribuidos en concentraciones mínimas dentro del tejido analizado [8].

   Janfelt y sus colegas [10] pudieron distinguir entre epidermis y dermis utilizando MSI sobre fosfolípidos. Utilizaremos esta técnica para identificar biomarcadores tumorales endógenos presentes en tumores de piel pero no presentes (o en diferentes intensidades) en la piel normal adyacente. Integrar MSI en el arsenal de diagnóstico para NMSC, utilizando la tecnología para diferenciar en tiempo real firmas lipídicas de membrana específicas de tejido maligno y benigno.

   El objetivo a largo plazo más allá de este proyecto, si es posible identificar patrones de lípidos capaces de distinguir la piel maligna de la sana, es introducir la espectrometría de masas por ionización por evaporación rápida (REIMS), ahora también como iKnife [11]. Este método tiene el potencial de ser mucho más sensible al identificar directamente las firmas químicas del tumor en lugar de la simple anatomía del tejido, además de requerir menos trabajo y tiempo. La técnica REIMS consiste en una pieza de mano electroquirúrgica conectada a un espectrómetro de masas, capaz de realizar la identificación de tejido en tiempo real utilizando el tejido aerosolizado producido durante la electrocirugía. La identificación de tejidos se logra mediante la comparación automatizada de espectros de masas registrados durante la cirugía, con una "biblioteca de referencia" preexistente. La modalidad proporciona al cirujano información inmediata sobre qué tipo de tejido se está cortando, guiando el tratamiento al delinear los márgenes del cáncer con asombrosa precisión. Los perfiles lipidómicos mostraron variación entre los tipos de tumores histológicos, lo que permitió distinguir los tejidos al actuar como biomarcadores [12]. REIMS también ha demostrado su eficacia en otros campos como forma de afirmar la autenticidad y la calidad del producto. Así, en la industria alimentaria, REIMS se utiliza para distinguir entre carne de vacuno y de caballo en <3 segundos, con una precisión del 100 % [13].

3. Método 3.1 Diseño del estudio para pacientes con BCC y SCC Cuando los pacientes son remitidos para un procedimiento quirúrgico de Mohs en el Departamento de Dermatología del Hospital Bispebjerg, se extraen los BCC o SCC y el tejido se incluye, secciona y tiñe para que el cirujano de Mohs evalúe si hay más tejido. es necesario eliminarlo. En nuestro estudio se utilizarán tres secciones de piel (de 5 a 10 um de grosor) de este tejido ya extirpado. Una sección se tiñerá con HE para que sepamos exactamente dónde están las regiones de interés. Se utilizarán dos secciones para el análisis de MS (espectro MSI y espectro REIMS).

   Actualmente, estamos realizando la cirugía de Mohs en CBC de alto riesgo en el Departamento de Dermatología del Hospital Bispebjerg, pero la cirugía de Mohs de CCE se incluirá dentro de un año.

   3.2 Diseño del estudio para pacientes con queratosis actínica Cuando los pacientes son remitidos para un procedimiento para haber tratado varias queratosis actínicas (grado 1, 2 o 3) en el Departamento de Dermatología del Hospital Bispebjerg, tomaremos una biopsia en sacabocados adicional (2-4 mm) dependiendo sobre el tamaño de la lesión. La biopsia se incluye y se secciona. Utilizaremos 3 secciones de piel (de 5-10 um de grosor). Una sección se tiñerá con HE para que sepamos exactamente dónde están las regiones de interés. Se utilizarán dos secciones para el análisis de EM en el Departamento de Farmacia de la Universidad de Copenhague. Incluiremos queratosis actínicas de hasta 100 pacientes.

   3.3 Microarrays de tejido La sección mencionada anteriormente para MSI proporcionará conocimientos sobre un único tumor en comparación con el tejido normal adyacente. Sin embargo, también necesitamos comparar a los pacientes entre sí y, por lo tanto, debemos crear una micromatriz de tejido.

   Haremos la micromatriz de tejido a partir del tejido de queratosis actínica/BCC/SCC extraído e incrustado. Una sección se analizará mediante MSI con el mismo procedimiento descrito anteriormente y las secciones adicionales se teñirán con HE para la evaluación de patología y marcadores inmunohistoquímicos tradicionales como Ki67 y p53.

4. Cálculos estadísticos Se realizará un análisis estadístico multivariado en todos los espectros de masas utilizando Matlab o un programa similar. Se utilizará un análisis discriminante lineal para identificar diferencias espectrales entre tejido premaligno, canceroso y normal. El desempeño de la clasificación se registrará con un esquema de validación cruzada en el que se deja fuera a un paciente. El número de muestras se basa en el cálculo del tamaño de la muestra y en publicaciones previas sobre otras formas de cáncer y se estima que es suficiente para generar una biblioteca de referencia. Estamos planeando un estudio de una variable de respuesta continua de pares emparejados de sujetos de estudio. Los datos anteriores indican que la diferencia en la respuesta de los pares emparejados se distribuye normalmente con una desviación estándar de 8. Si la verdadera diferencia en la respuesta media de pares emparejados es 3, necesitaremos estudiar 58 pares de sujetos para poder rechazar la hipótesis nula de que esta diferencia de respuesta es cero con probabilidad (potencia) de 0,8. La probabilidad de error Tipo I asociada a esta prueba de hipótesis nula es 0,05. (programado utilizado para el cálculo del tamaño de la muestra; Cálculo de potencia y tamaño de la muestra, PS, Universidad de Vanderbilt; versión 3.1.2). Según estos cálculos, reclutaremos entre 60 y 100 pacientes con BCC, AK y SCC. Mínimo será de 180 pacientes y máximo de 300 pacientes.

5. Participantes En total, se reclutará un máximo de 300 pacientes para ingresar al estudio. Se incluyen hombres y mujeres de 18 años o más que cumplan con los criterios de inclusión y exclusión. Todos los pacientes potenciales serán reclutados en el Departamento de Dermatología del Hospital Universitario de Bispebjerg.

   Los pacientes interesados ​​serán invitados a una visita de selección de información preliminar en la que recibirán información oral completa sobre el estudio por parte de la investigadora principal, Catharina Lerche, el cirujano de Mohs Martin Gluud o la enfermera del proyecto June Svendsen, y se les entregará información escrita. La reunión se llevará a cabo en una oficina separada para garantizar un ambiente seguro y tranquilo. Se informa específicamente a los pacientes que pueden traer uno o más evaluadores a todas las reuniones e intervenciones si así lo desean. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito en el momento de la inclusión el día del procedimiento quirúrgico que se llevará a cabo al menos 24 horas después de la visita de selección.

   Cada paciente será evaluado por el investigador para evaluar la idoneidad de ingresar al estudio. Para garantizar un grupo homogéneo de comparación óptica, el reclutamiento se realizará según los siguientes criterios:

   5.1 Criterios de inclusión • Pacientes mayores de 18 años.

   • Pacientes que presentan QA, SCC y BCC.

   • Consentimiento informado por escrito obtenido del paciente.

   5.2 Criterios de exclusión • Pacientes inmunodeprimidos

6. Riesgos potenciales y efectos adversos Todos los pacientes serán informados tanto verbalmente como por escrito sobre los riesgos y posibles efectos secundarios.

   6.1 Biopsia por punción Para pacientes con BCC y SCC solo usaremos tejido que ya se extrajo mediante el procedimiento estándar de Mohs. Para pacientes con queratosis actínica se obtendrá una biopsia bajo anestesia local, con 2, 3 o 4 mm de diámetro y 3 mm de profundidad. Cada biopsia dejará una cicatriz redonda de 2 mm o 4 mm de diámetro que se endurece en 2 semanas. La inyección de anestesia local puede causar dolor y sensación de hormigueo/picazón en el lugar de la inyección. Existe una posibilidad mínima de infección, pero la trataremos si ocurre.

7. Biobanco Se creará un biobanco de investigación de conformidad con la ley del comité §2 nr. 13. Todas las posibles biopsias/secciones se mantendrán en un congelador cerrado con llave a -80 °C en el Departamento de Dermatología del Hospital Universitario de Bispebjerg hasta su análisis en el Departamento de Farmacia de la Universidad de Copenhague, Universitetsparken 2, 2100 Copenhague Ø. No siempre podemos hacer el análisis dentro de 5 a 7 días porque toma hasta 20 horas hacer una imagen MSI y si tenemos varios pacientes con BCC/SCC/queratosis actínica en un día habrá un retraso. Al realizar la micromatriz de tejido, recolectaremos tejido de 6 a 8 pacientes antes del análisis. Después del análisis MSI, las muestras serán destruidas. La destrucción de las partes restantes de los bloques de biopsia y de los bloques de microarrays de tejido se realizará a más tardar 1. Enero de 2025. No se conservará ningún tejido para investigaciones inespecíficas.
8. Información de los diarios de los pacientes El personal de salud utilizará información sobre la descripción patológica de la lesión sospechada del diario del paciente al evaluar a los posibles pacientes que se incluirán en este estudio. Después de que el paciente firme el consentimiento informado, se utilizará información del diario del paciente sobre la descripción del tipo de tumor, ubicación, tamaño y si se trata de una lesión recurrente.

9. Protección de datos, almacenamiento de información y control de calidad 9.1 Control de calidad Se respetará la declaración de Helsinki II, así como los estándares de una buena investigación clínica. Se mantendrá el respeto a la privacidad y a la integridad física y mental de los pacientes. El estudio se registrará en el Comité de Ética en Investigación en Salud y en la Agencia Danesa de Protección de Datos.

   9.2 Protección y almacenamiento de datos Se respetará el Reglamento General de Protección de Datos (danés: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen). La investigación que utiliza datos de la Región Capital de Dinamarca se considera investigación pública. El uso y distribución de los datos recopilados en este estudio se discutirán con los pacientes durante el proceso de consentimiento. El proyecto se informará al Centro Danés de Conocimiento sobre Cumplimiento de la Protección de Datos (danés: Videncenter for Dataanmeldelse, Región Hovedstaden). Se elaborará una lista de pacientes seleccionados y pacientes, incluidos los nombres, el número de identificación del estudio y la fecha de nacimiento. Todos los datos recopilados serán anonimizados y protegidos por la ley danesa relativa a la gestión de información personal y la Ley de salud danesa (danés: Sundhedsloven). Los datos se registrarán y almacenarán durante 5 años después de la finalización del estudio en el Departamento de Dermatología del Hospital Bispebjerg.

10. Consideraciones financieras El estudio fue concebido por la investigadora principal Catharina M. Lerche. Las empresas comerciales no han concebido ningún apoyo financiero. El departamento de Dermatología del Hospital Universitario de Bispebjerg proporcionará el salario de la investigadora principal Catharina M Lerche. Otros gastos relacionados con el proyecto están cubiertos por la Sociedad Danesa contra el Cáncer (Knæk Cancer midler 1,6 millones de DKK) y la Fundación Lundbeck (10 millones de DKK). La investigadora principal Catharina M. Lerche y los colaboradores no tienen ninguna relación personal ni interés económico en la Sociedad Danesa del Cáncer ni en la Fundación Lundbeck.
11. Reembolsos No habrá reembolsos a los pacientes.

12. Información a los pacientes La investigadora principal, Catharina M. Lerche, es responsable de brindar información clara, verbal y por escrito, sobre el objetivo, el diseño y los riesgos del estudio, como se indica en "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" del Ministerio de Salud danés ( Danés: Sundheds- og Ældreministeriet). En un entorno tranquilo, se informará al participante de su derecho a tener uno o más evaluadores presentes, que el participante es voluntario y que la retirada es posible en cualquier momento durante el estudio. A los pacientes se les dará el tiempo de consideración adecuado (mínimo 24 horas). Se pedirá a los pacientes que firmen un formulario de consentimiento.

    Se instará al paciente a leer el material adjunto a la derecha del participante del estudio. No se iniciarán procedimientos del estudio antes de que los participantes hayan firmado el consentimiento informado. La persona de contacto, Catharina M. Lerche, responderá a las preguntas adicionales de los pacientes.

13. Publicación de resultados Se publicarán los resultados positivos, negativos y no concluyentes. El objetivo es publicar y presentar los resultados en una revista dermatológica internacional revisada por pares y/o en congresos dermatológicos. Los derechos de propiedad intelectual de los resultados pertenecen al Hospital Universitario de Bispebjerg. Las publicaciones se realizarán de acuerdo con las pautas de Vancouver.
14. Ética Las biopsias se tomarán en el Departamento de Dermatología del Hospital Universitario de Bispebjerg. La información personal y las muestras se tratan conforme a la Ley de Datos Personales y Ley de Salud. Además, el proyecto se lleva a cabo con riesgos mínimos para la salud y la seguridad de los participantes.

Los procedimientos quirúrgicos son un acontecimiento diario en hospitales y clínicas de todo el mundo. Este estudio de biomarcadores de NMSC y el desarrollo de un nuevo tratamiento para el cáncer de piel basado en espectrometría de masas tiene el potencial de reducir la recurrencia, la morbilidad y los costos del tumor. Aún no se ha realizado un estudio de los biomarcadores de NMSC y la implementación clínica de REIMS en el tratamiento del cáncer de piel. Se anticipa que los riesgos potenciales de efectos adversos en este estudio son pequeños y que existe un beneficio potencial de mejora en la recurrencia del tumor, la morbilidad, los costos, menos mano de obra y menos tiempo. El potencial de ganancias futuras basadas en evidencia y las perspectivas futuras que este estudio puede brindar deben considerarse frente a las molestias de los participantes durante la biopsia y la visita adicional al Hospital Bispebjerg. Se seguirán las leyes danesas sobre los derechos y la compensación de los pacientes.

15. Seguros Hospital Bispebjerg

16. Referencias

1. Dieta, nutrición, actividad física y cáncer de piel. 2018.
2. Lamberg, AL y col. La base de datos dermatológica danesa sobre cáncer de piel no melanoma. Clínico. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. y col. La ingesta de alcohol puede modificar el riesgo de cáncer de piel no melanoma: resultados de un gran estudio de cohorte prospectivo danés. J. Invertir. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. Nuevos conceptos para el carcinoma de células basales. Factores de riesgo demográficos, clínicos, histológicos y biomarcadores. Una revisión sistemática de la evidencia sobre el riesgo de desarrollo tumoral, la susceptibilidad a una segunda primaria y la recurrencia. J. Cirugía. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. y col. Costos de las enfermedades por cáncer de piel melanoma y no melanoma en Dinamarca. EUR. J. Cáncer Anterior. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, NWJ et al. Cirugía micrográfica de Mohs para el tratamiento del carcinoma basocelular de la cara - Resultados de un estudio retrospectivo y revisión de la literatura. Hno. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et al. Imágenes por espectrometría de masas en el desarrollo de fármacos. Anal. Química. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, IS et al. Combinación de MALDI-MSI y dosificación en casete para la evaluación de la distribución de fármacos en explantes de piel humana. Anal. Bioanal. Química. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et al. Identificación de tejidos biológicos mediante espectrometría de masas de ionización evaporativa rápida. Anal. Química. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et al. Identificación de tejido intraoperatorio mediante espectrometría de masas de ionización por evaporación rápida. Ciencia. Traducción Medicina. 5, (2013).

13. Balog, J. et al. Identificación de las especies de origen de productos cárnicos mediante espectrometría de masas de ionización evaporativa rápida. J. Agrícola. Química de los alimentos. 64, 4793-4800 (2016).