Biomarkery nowotworów skóry metodą obrazowania spektrometrią mas

1. Tytuł Biomarkery nowotworów skóry metodą obrazowania spektrometrią mas

2. Cel 2.1 Definicja problemu W 2018 roku na całym świecie u ponad 1 miliona pacjentów zdiagnozowano nieczerniakowego raka skóry (NMSC), a liczba ta może być niedoszacowana ze względu na brak rejestrów lub niepełną rejestrację tego typu nowotworów [1]. W diagnostyce nowotworów niezwykle istotne jest szybkie wykrycie guzów mikroskopowych. Wierzymy, że obrazowanie spektrometrią mas (MSI) może z powodzeniem zlokalizować mikroskopijne skupiska powszechnie występującego raka skóry, raka podstawnokomórkowego (BCC) i raka kolczystokomórkowego (SCC) i odróżnić je ex vivo od sąsiadującej prawidłowej skóry. MSI ujawnia zmieniony profil chemiczny w regionie BCC i SCC (wzory lipidowe) i nie opiera się na wizualnej identyfikacji cech histopatologicznych.

   2.2 Hipoteza Stawiamy hipotezę, że komórki NMSC wykazują specyficzne, endogenne biomarkery (wzory lipidowe), które różnią się od zdrowej tkanki skóry w skrawkach biopsji skóry. Jeśli ta hipoteza okaże się prawidłowa, w przyszłości możliwe będzie opracowanie diagnostyki tkanek i leczenia NMSC w czasie rzeczywistym za pomocą chirurgii sterowanej spektrometrią mas.

   2.3 Miary wyników

   • Identyfikacja mas i rozkładów wybranych biomarkerów lipidowych w skrawkach tkanki BCC i SCC usuniętej z operacji Mohsa.
   • Identyfikacja mas i rozkładów wybranych biomarkerów lipidowych w skrawkach biopsji z rogowaceniem słonecznym (zmianami przednowotworowymi).

   2.4 Kontekst Według raportu World Cancer Research Fund z 2019 r. na raka skóry nieczerniakowego (NMSC) zapadalność na raka skóry niebędącego czerniakiem wyniosła 1 milion osób w 2018 r. i jest on klasyfikowany jako najczęstszy nowotwór na świecie [1]. NMSC obejmuje przede wszystkim raka podstawnokomórkowego (BCC) i raka kolczystokomórkowego (SCC).

   W Danii i innych krajach zachodnich częstość występowania tych nowotworów jest również wysoka [2], a zachorowalność w Danii stale rośnie i wynosi 15 000 rocznie. Głównym czynnikiem ryzyka NMSC jest narażenie na promieniowanie ultrafioletowe (UVR). Jasny kolor skóry, jasne lub rude włosy, jasny kolor oczu i osoby z obniżoną odpornością to inne ustalone przyczyny NMSC [1,3].

   Duńska populacja to przeważnie ludzie o jasnej karnacji, mobilni geograficznie i niezwykle kochający słońce, co zwiększa ryzyko zachorowania na raka skóry. Codziennie u ~44 Duńczyków diagnoza NMSC obejmuje BCC lub SCC, przy czym u 40% w kolejnych latach rozwijają się nowe nowotwory [4] NMSC charakteryzuje się niską śmiertelnością, jednakże charakteryzuje się znaczną zachorowalnością pacjentów ze względu na wysoką częstość występowania i nawroty [2], które kosztują w Danii ponad 19 milionów euro rocznie, przekraczając koszty zarządzania opieką zdrowotną i koszty opieki zdrowotnej nad czerniakiem [5]. Opieką nad NMSC zajmują się głównie dermatolodzy, a w leczeniu NMSC można zastosować wiele metod, takich jak chirurgia mikrograficzna Mohsa, wycięcie, krioterapia i różne metody miejscowe [2].

   Najmniejsza częstość nawrotów chirurgii mikrograficznej metodą Mohsa sprawia, że ​​ta operacja wycięcia jest leczeniem pierwszego wyboru w przypadku NMSC wysokiego ryzyka [6]. Podczas tej operacji pod mikroskopem tkanka jest wycinana, dzielona na skrawki, barwiona i oceniana przez przeszkolonego patologa. Pacjent czeka na stole operacyjnym, podczas którego sprawdzane są brzegi tkanek pod kątem komórek nowotworowych, co skłania do dalszego usuwania tkanki z obszaru leczenia. W związku z tym operacja Mohsa jest czasochłonna i kosztowna ze względu na ograniczoną liczbę pacjentów, których można leczyć dziennie, oraz zapotrzebowanie na wysoko wyszkolony personel laboratoryjny.

   Od dziesięcioleci laboratoria korzystają z imponującej czułości i swoistości spektrometrii mas (MS). MS, dobrze ugruntowana technika analityczna, jonizuje związki i sortuje je na podstawie ich masy cząsteczkowej. Obrazowanie MS (MSI) w podobny sposób wizualizuje przestrzenne rozmieszczenie cząsteczek. Skanowanie całych skrawków tkanek (np. skóra) i generując widmo masowe dla każdego obszaru jednostkowego, dostarczana jest mapa rozmieszczenia związku w tkankach.

   MSI może wykryć jednocześnie wiele endogennych gatunków molekularnych, w tym lipidy, małe białka, a także egzogenne leki farmaceutyczne rozmieszczone w minimalnych stężeniach w analizowanej tkance [8].

   Janfelt i współpracownicy [10] byli w stanie rozróżnić naskórek od skóry właściwej za pomocą MSI na fosfolipidach. Wykorzystamy tę technikę do identyfikacji endogennych biomarkerów nowotworowych obecnych w nowotworach skóry, ale nieobecnych (lub w różnym natężeniu) w sąsiadującej normalnej skórze. Włączenie MSI do arsenału diagnostycznego NMSC, wykorzystanie technologii do różnicowania w czasie rzeczywistym specyficznych sygnatur lipidów błonowych tkanki złośliwej i łagodnej.

   Długoterminowym celem wykraczającym poza ten projekt, jeśli możliwa będzie identyfikacja wzorców lipidowych umożliwiających rozróżnienie skóry złośliwej od zdrowej, jest wprowadzenie spektrometrii masowej z jonizacją z szybkim odparowaniem (REIMS), obecnie również jako iKnife [11]. Metoda ta może być znacznie bardziej czuła poprzez bezpośrednią identyfikację chemicznych sygnatur guza niż prostej anatomii tkanki, a ponadto jest mniej pracochłonna i czasochłonna. Technika REIMS składa się z głowicy elektrochirurgicznej połączonej ze spektrometrem mas, zdolnym do przeprowadzania identyfikacji tkanek w czasie rzeczywistym przy użyciu tkanki w aerozolu wytwarzanej podczas elektrochirurgii. Identyfikację tkanek uzyskuje się poprzez automatyczne dopasowanie widm mas zarejestrowanych podczas operacji do istniejącej „biblioteki referencyjnej”. Metoda ta zapewnia chirurgowi natychmiastową informację o rodzaju wycinanej tkanki, co pozwala na prowadzenie leczenia poprzez określenie marginesów nowotworu ze zdumiewającą precyzją. Profile lipidomiczne wykazały różnice między typami nowotworów histologicznych, umożliwiając rozróżnienie tkanek, działając jako biomarkery [12]. REIMS okazał się również skuteczny w innych dziedzinach jako sposób potwierdzania autentyczności i jakości produktu. I tak w przemyśle spożywczym REIMS służy do rozróżnienia mięsa wołowego od końskiego w czasie <3 sekund, ze 100% dokładnością [13].

3. Metoda 3.1 Projekt badania dla pacjentów z BCC i SCC Kiedy pacjenci są kierowani na zabieg chirurgiczny Mohsa na oddziale dermatologicznym, w szpitalu Bispebjerg usuwa się BCC lub SCC, a tkankę osadza się, dzieli na kawałki i barwi dla chirurga Mohsa w celu oceny, czy jest więcej tkanki trzeba usunąć. W naszych badaniach zostaną wykorzystane trzy skrawki skóry (grubość 5-10 µm) tej tkanki, która została już usunięta. Jedna sekcja zostanie wybarwiona HE, abyśmy wiedzieli dokładnie, gdzie znajdują się interesujące obszary. Do analizy MS zostaną wykorzystane dwie sekcje (widmo MSI i widmo REIMS).

   Obecnie przeprowadzamy operację Mohsa w przypadku BCC wysokiego ryzyka na oddziale dermatologii szpitala Bispebjerg, ale operacja Mohsa w przypadku raka kolczystokomórkowego zostanie włączona w ciągu roku.

   3.2 Projekt badania dla pacjentów z rogowaceniem słonecznym W przypadku skierowania pacjentów na zabieg mający na celu leczenie kilku rogowaceń słonecznych (stopnia 1, 2 lub 3) na Oddziale Dermatologii Szpitala Bispebjerg, w zależności od od wielkości zmiany. Biopsję zatapia się i dzieli na kawałki. Będziemy używać 3 skrawków skóry (o grubości 5-10 um). Jedna sekcja zostanie wybarwiona HE, abyśmy wiedzieli dokładnie, gdzie znajdują się interesujące obszary. Dwie sekcje zostaną wykorzystane do analizy stwardnienia rozsianego na Wydziale Farmacji Uniwersytetu w Kopenhadze. Uwzględnimy rogowacenie słoneczne od maksymalnie 100 pacjentów.

   3.3 Mikromacierz tkankowa Wspomniany powyżej skrawek MSI dostarczy wiedzy na temat pojedynczego guza w porównaniu z sąsiadującą normalną tkanką. Musimy jednak także porównywać pacjentów między sobą i dlatego musimy wykonać mikromacierz tkankową.

   Z usuniętej i osadzonej tkanki rogowacenia aktynowego/BCC/SCC wykonamy mikromacierz tkankową. Jeden skrawek zostanie przeanalizowany przez MSI zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano powyżej, a dodatkowe skrawki zostaną wybarwione HE w celu oceny patologii i tradycyjnych markerów immunohistochemicznych, takich jak Ki67 i p53.

4. Obliczenia statystyczne Wielowymiarowa analiza statystyczna zostanie przeprowadzona na wszystkich widmach masowych przy użyciu programu Matlab lub podobnego programu. Liniowa analiza dyskryminacyjna zostanie wykorzystana do identyfikacji różnic widmowych między tkanką przednowotworową, nowotworową i prawidłową. Wyniki klasyfikacji będą rejestrowane w ramach schematu walidacji krzyżowej typu „pomiń jednego pacjenta”. Liczbę próbek oblicza się na podstawie obliczeń wielkości próbki i wcześniejszych publikacji na temat innych postaci nowotworów i szacuje się, że jest ona wystarczająca do wygenerowania biblioteki referencyjnej. Planujemy badanie zmiennej odpowiedzi ciągłej od dopasowanych par badanych. Wcześniejsze dane wskazują, że różnica w odpowiedzi dopasowanych par ma rozkład normalny z odchyleniem standardowym 8. Jeśli prawdziwa różnica w średniej odpowiedzi dopasowanych par wynosi 3, będziemy musieli zbadać 58 par osób, aby móc odrzucić hipotezę zerową, że ta różnica odpowiedzi wynosi zero z prawdopodobieństwem (mocą) 0,8. Prawdopodobieństwo błędu typu I związane z tym testem tej hipotezy zerowej wynosi 0,05. (zaprogramowany do obliczania wielkości próby; Obliczanie mocy i wielkości próbki, PS, Vanderbilt University; wersja 3.1.2). Na podstawie tych obliczeń zrekrutujemy od 60 do 100 pacjentów z BCC, AK i SCC. Minimalnie będzie to 180 pacjentów, a maksymalnie 300 pacjentów.

5. Uczestnicy Do udziału w badaniu zostanie zrekrutowanych łącznie maksymalnie 300 pacjentów. Uwzględniono mężczyzn i kobiety w wieku 18 lat lub starszych, którzy spełniają kryteria włączenia i wyłączenia. Wszyscy potencjalni pacjenci będą rekrutowani z Oddziału Dermatologii Szpitala Uniwersyteckiego Bispebjerg.

   Zainteresowani pacjenci zostaną zaproszeni na wstępną wizytę przesiewową, podczas której otrzymają wyczerpujące ustne informacje na temat badania od głównego badacza, Cathariny Lerche, chirurga Mohsa Martina Gluuda lub pielęgniarki projektu June Svendsen, a także zostaną przekazane informacje pisemne. Spotkanie odbędzie się w wydzielonym biurze, aby zapewnić bezpieczne i spokojne otoczenie. Pacjenci są wyraźnie informowani, że na wszystkie spotkania i interwencje mogą przyprowadzić jednego lub więcej oceniających, jeśli tak zdecydują. Pisemna świadoma zgoda zostanie zapewniona w momencie włączenia w dniu zabiegu chirurgicznego, który odbędzie się co najmniej 24 godziny po wizycie przesiewowej.

   Każdy pacjent zostanie oceniony przez badacza w celu oceny przydatności włączenia do badania. Aby zapewnić jednorodną grupę porównania optycznego, rekrutacja zostanie przeprowadzona według następujących kryteriów:

   5.1 Kryteria włączenia • Pacjenci w wieku powyżej 18 lat.

   • Pacjenci zgłaszający się z AK, SCC i BCC.

   • Pisemna świadoma zgoda uzyskana od pacjenta.

   5.2 Kryteria wykluczenia • Pacjenci z obniżoną odpornością

6. Potencjalne ryzyko i działania niepożądane Wszyscy pacjenci zostaną poinformowani ustnie i pisemnie o ryzyku i możliwych skutkach ubocznych.

   6.1 Biopsja sztancowa W przypadku pacjentów z BCC i SCC użyjemy wyłącznie tkanki, która została już usunięta standardową procedurą Mohsa. U pacjentów z rogowaceniem słonecznym w znieczuleniu miejscowym zostanie pobrana biopsja o średnicy 2, 3 lub 4 mm i głębokości 3 mm. Każda biopsja pozostawia okrągłą bliznę o średnicy 2 mm lub 4 mm, która w ciągu 2 tygodni zanika. Wstrzyknięcie znieczulenia miejscowego może powodować ból i uczucie mrowienia/kłucia w miejscu wstrzyknięcia. Ryzyko infekcji jest minimalne, ale jeśli do niej dojdzie, będziemy ją leczyć.

7. Biobank Biobank badawczy zostanie utworzony zgodnie z ustawą komitetową §2 nr. 13. Wszystkie potencjalne biopsje/skrawki będą przechowywane w zamkniętej zamrażarce o temperaturze -80°C na Oddziale Dermatologii Szpitala Uniwersyteckiego Bispebjerg do czasu analizy na Wydziale Farmacji Uniwersytetu w Kopenhadze, Universitetsparken 2, 2100 Kopenhaga Ø. Nie zawsze możemy przeprowadzić analizę w ciągu 5-7 dni, ponieważ wykonanie jednego zdjęcia MSI zajmuje do 20 godzin, a jeśli mamy kilku pacjentów z BCC/SCC/rogowaceniem słonecznym w ciągu jednego dnia, wystąpi opóźnienie. Wykonując mikromacierz tkankową, przed analizą pobierzemy tkankę od 6-8 pacjentów. Po analizie MSI próbki zostaną zniszczone. Zniszczenie pozostałych części bloków biopsyjnych i bloków mikromacierzy tkankowych nastąpi nie później niż 1. Styczeń 2025. Żadna tkanka nie będzie przechowywana do celów niespecyficznych badań.
8. Informacje z dzienników pacjentów Personel służby zdrowia będzie korzystał z informacji dotyczących opisu patologicznego podejrzanej zmiany z dziennika pacjenta podczas badania przesiewowego potencjalnych pacjentów, którzy zostaną włączeni do tego badania. Po podpisaniu przez pacjenta świadomej zgody wykorzystane zostaną informacje z dziennika pacjenta dotyczące opisu rodzaju nowotworu, lokalizacji, wielkości oraz tego, czy jest to zmiana nawrotowa.

9. Ochrona danych, przechowywanie informacji i kontrola jakości 9.1 Kontrola jakości Deklaracja Helsinki II będzie przestrzegana, podobnie jak standardy dobrych badań klinicznych. Zachowane zostanie poszanowanie prywatności oraz integralności fizycznej i psychicznej pacjentów. Badanie zostanie zarejestrowane przez Komisję ds. Etyki Badań Zdrowotnych i Duńską Agencję Ochrony Danych.

   9.2 Ochrona i przechowywanie danych Ogólne rozporządzenie o ochronie danych (duńskie: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) będzie przestrzegane. Badania z wykorzystaniem danych Regionu Stołecznego Danii uznawane są za badania publiczne. Wykorzystanie i dystrybucja danych zebranych w tym badaniu zostaną omówione z pacjentami w procesie uzyskiwania zgody. Projekt zostanie zgłoszony do Duńskiego Centrum Wiedzy na temat Zgodności z Ochroną Danych (duński: Videncenter for Dataanmeldelse, Region Hovedstaden). Zostanie opracowana lista osób poddanych badaniu przesiewowemu i pacjentów, zawierająca nazwiska, numer identyfikacyjny badania i datę urodzenia. Wszystkie zebrane dane będą anonimowe i chronione duńskim prawem dotyczącym zarządzania danymi osobowymi oraz duńską ustawą o zdrowiu (duńską: Sundhedsloven). Dane będą rejestrowane i przechowywane przez 5 lat po zakończeniu badania na oddziale dermatologicznym szpitala Bispebjerg.

10. Względy finansowe Autorką badania jest główna badaczka Catharina M. Lerche. Spółki komercyjne nie zapewniły żadnego wsparcia finansowego. Oddział Dermatologii Szpitala Uniwersyteckiego Bispebjerg zapewni wynagrodzenie głównej badaczce Catharinie M. Lerche. Pozostałe wydatki związane z projektem pokrywa Duńskie Towarzystwo ds. Walki z Rakiem (Knæk Cancer midler 1,6 mln DKK) i Fundacja Lundbecka (10 mln DKK). Główna badaczka Catharina M. Lerche i współpracownicy nie mają żadnych powiązań osobistych ani powiązań ekonomicznych z Duńskim Towarzystwem Onkologicznym ani Fundacją Lundbecka.
11. Zwroty kosztów Pacjenci nie otrzymają żadnych zwrotów kosztów.

12. Informacje dla pacjentów Główna badaczka, Catharina M. Lerche, jest odpowiedzialna za udzielenie jasnych, ustnych i pisemnych informacji na temat celu, projektu i ryzyka badania, jak określono w „Informacjach og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter” duńskiego Ministerstwa Zdrowia ( duński: Sundheds- og Ældreministeriet). W niezakłóconej atmosferze uczestnik zostanie poinformowany o przysługującym mu prawie do obecności jednego lub większej liczby oceniających, przy czym udział ten jest dobrowolny i że wycofanie się jest możliwe w dowolnym momencie badania. Pacjenci otrzymają odpowiedni czas na rozważenie leczenia (co najmniej 24 godziny). Pacjenci zostaną poproszeni o podpisanie formularza zgody.

    Pacjent zostanie poproszony o zapoznanie się z załączonym materiałem po prawej stronie uczestnika badania. Żadne procedury badawcze nie zostaną rozpoczęte przed podpisaniem przez uczestników świadomej zgody. Na dodatkowe pytania pacjentów odpowie osoba kontaktowa, Catharina M. Lerche

13. Publikacja wyników Wyniki pozytywne, negatywne i niejednoznaczne zostaną opublikowane. Celem jest publikacja i prezentacja wyników w recenzowanym międzynarodowym czasopiśmie dermatologicznym i/lub na konferencjach dermatologicznych. Prawa własności intelektualnej do wyników należą do Szpitala Uniwersyteckiego Bispebjerg. Publikacje będą zgodne z wytycznymi z Vancouver.
14. Etyka Biopsje zostaną pobrane na Oddziale Dermatologii Szpitala Uniwersyteckiego Bispebjerg. Dane osobowe i próbki są traktowane zgodnie z ustawą o danych osobowych i ustawie o zdrowiu. Ponadto projekt jest realizowany przy minimalnym ryzyku dla zdrowia i bezpieczeństwa uczestników.

Zabiegi chirurgiczne to codzienność w szpitalach i klinikach na całym świecie. To badanie biomarkerów NMSC i opracowanie nowego sposobu leczenia raka skóry w oparciu o spektrometrię mas może potencjalnie zmniejszyć nawroty nowotworu, zachorowalność i koszty. Nie przeprowadzono jeszcze badań biomarkerów NMSC i klinicznego zastosowania REIMS w leczeniu raka skóry. Oczekuje się, że potencjalne ryzyko wystąpienia działań niepożądanych w tym badaniu jest małe i że istnieje potencjalna korzyść w postaci poprawy w zakresie nawrotów nowotworu, zachorowalności i kosztów, która jest mniej pracochłonna i czasochłonna. Potencjał przyszłych korzyści opartych na dowodach oraz przyszłe perspektywy, jakie może zapewnić to badanie, należy uwzględnić w kontekście dyskomfortu uczestników podczas biopsji i dodatkowej wizyty w szpitalu Bispebjerg. Duńskie przepisy dotyczące praw pacjentów i odszkodowań będą przestrzegane.

15. Ubezpieczenie Szpitala Bispebjerg

16. Referencje

1. Dieta, odżywianie, aktywność fizyczna a rak skóry. 2018.
2. Lamberg, AL i in. Duńska baza danych dermatologii na raka skóry nieczerniakowego. Clin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. i in. Spożywanie alkoholu może modyfikować ryzyko raka skóry niebędącego czerniakiem: wyniki dużego duńskiego prospektywnego badania kohortowego. J. Inwestuj. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. i Triaridis, S. Nowe koncepcje raka podstawnokomórkowego. Demograficzne, kliniczne, histologiczne czynniki ryzyka i biomarkery. Systematyczny przegląd dowodów dotyczących ryzyka rozwoju nowotworu, podatności na drugą pierwotną postać nowotworu i nawrotu. J. Surg. Rozdzielczość 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. i in. Koszty leczenia czerniaka i raka skóry nieczerniakowego w Danii. EUR. J. Rak Poprzednia 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, N. W. J. i in. Chirurgia mikrograficzna Mohsa w leczeniu raka podstawnokomórkowego twarzy - Wyniki badania retrospektywnego i przegląd literatury. br. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. i in. Obrazowanie spektrometrią mas w opracowywaniu leków. Analny. Chem. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I. S. i in. Połączenie MALDI-MSI i dawkowania kasetowego do oceny dystrybucji leku w eksplantacie ludzkiej skóry. Analny. Bioanal. Chem. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. i in. Identyfikacja tkanek biologicznych metodą szybkiej spektrometrii mas z jonizacją przez odparowanie. Analny. Chem. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. i in. Śródoperacyjna identyfikacja tkanek przy użyciu szybkiej spektrometrii mas z jonizacją przez odparowanie. Nauka. Tłumacz. Med. 5, (2013).

13. Balog, J. i in. Identyfikacja gatunku pochodzenia produktów mięsnych metodą szybkiej spektrometrii mas z jonizacją przez odparowanie. J.Agrik. Chemia żywności. 64, 4793-4800 (2016).