Ihokasvainten biomarkkerit massaspektrometrialla

1. Otsikko Ihokasvaimen biomarkkerit massaspektrometrialla

2. Tavoite 2.1 Ongelmanmäärittely Yli miljoonalla potilaalla diagnosoitiin ei-melanooma-ihosyöpä (NMSC) maailmanlaajuisesti vuonna 2018, ja tätä määrää voidaan aliarvioida tämäntyyppisten syöpien rekisterien puutteen tai epätäydellisen rekisteröinnin vuoksi [1]. Mikroskooppisten kasvainten oikea-aikainen havaitseminen on syövän diagnostiikassa äärimmäisen tärkeää. Uskomme, että massaspektrometrialla (MSI) voidaan onnistuneesti paikantaa mikroskooppiset aggregaatit yleisestä ihosyövästä, tyvisolusyövästä (BCC) ja okasolusyövästä (SCC) ja erottaa ne viereisestä normaalista ihosta ex vivo. MSI paljastaa muuttuneen kemiallisen profiilin BCC- ja SCC-alueella (lipidikuviot) eikä luota histopatologisten piirteiden visuaaliseen tunnistamiseen.

   2.2 Hypoteesi Oletamme, että NMSC-soluissa on spesifisiä, endogeenisiä biomarkkereita (lipidikuvioita), jotka eroavat terveestä ihokudoksesta ihobiopsian osissa. Jos tämä hypoteesi pitää paikkansa, on tulevaisuudessa mahdollista kehittää reaaliaikainen kudosdiagnostiikka ja NMSC:n hoito massaspektrometrialla ohjatulla leikkauksella.

   2.3 Tulostoimenpiteet

   • Valittujen lipidibiomarkkerien massojen ja jakautumien tunnistaminen Mohsin leikkauksesta poistetun BCC- ja SCC-kudoksen osissa.
   • Valittujen lipidibiomarkkerien massojen ja jakaumien tunnistaminen biopsioista saaduissa leikkeissä, joissa on aktiinisia keratoosia (esipahanlaatuisia vaurioita).

   2.4 Tausta Maailman syöpätutkimusrahaston vuoden 2019 ihosyöpäraportin mukaan ei-melanooma-ihosyöpää (NMSC) esiintyi 1 miljoonalla ihmisellä vuonna 2018, ja se on luokiteltu yleisimmin esiintyväksi syöväksi maailmanlaajuisesti [1]. NMSC ympäröi pääasiassa tyvisolusyöpää (BCC) ja okasolusyöpää (SCC).

   Myös Tanskassa ja muissa länsimaissa näitä kasvaimia esiintyy paljon [2], ja Tanskassa ilmaantuvuus jatkaa nousuaan ja on 15 000 vuodessa. NMSC:n tärkein riskitekijä on altistuminen ultraviolettisäteilylle (UVR). Vaalea ihonväri, vaaleat tai punaiset hiukset, vaalea silmien väri ja immuunipuutteiset ihmiset ovat muita vakiintuneita syitä NMSC:lle [1,3].

   Tanskan väestö on pääosin vaaleaihoista, maantieteellisesti liikkuvaa ja erittäin aurinkoa rakastavaa, mikä lisää ihosyövän riskiä. Päivittäin noin 44 tanskalaista saa NMSC-diagnoosin, joka koostuu joko BCC:stä tai SCC:stä, ja 40 %:lle kehittyy uusia kasvaimia seuraavina vuosina [4] NMSC:llä on alhainen kuolleisuus, mutta sillä on huomattava potilaiden sairastuvuus korkean esiintyvyyden ja uusiutumisen vuoksi. [2], joka maksaa Tanskalle yli 19 miljoonaa euroa vuodessa, mikä ylittää melanooman terveydenhuolto- ja terveydenhuoltokustannukset [5]. NMSC:n hoidosta vastaavat ensisijaisesti ihotautilääkärit, ja NMSC:n hoidossa voidaan käyttää useita menetelmiä, kuten Mohsin mikrografiikkakirurgia, leikkaus, kryoterapia ja erilaisia ​​paikallisia hoitomuotoja [2].

   Mohsin mikrografisen leikkauksen alhaisimmat uusiutumisluvut tekevät tästä leikkausleikkauksesta ensimmäisen hoitovaihtoehdon korkean riskin NMSC:lle [6]. Tämän mikroskoopilla ohjatun leikkauksen aikana koulutettu patologi leikkaa, leikkaa, värjää ja arvioi kudoksen. Potilas odottaa leikkauspöydällä, kun kudosmarginaalit tutkitaan syöpäsolujen varalta. Tämä löydös saa aikaan lisäkudoksen poistamisen hoitoalueelta. Tästä syystä Mohsin leikkaus on aikaa vievää ja kallista, koska päivässä voidaan hoitaa rajoitettu määrä potilaita ja tarvitaan korkeasti koulutettua laboratoriohenkilöstöä.

   Laboratoriot ovat vuosikymmenten ajan hyötyneet massaspektrometrian (MS) vaikuttavasta herkkyydestä ja spesifisyydestä. Vakiintunut analyyttinen tekniikka, MS ionisoi yhdisteet ja lajittelee ne niiden molekyylimassan perusteella. MS-kuvantaminen (MSI) visualisoi molekyylien tilajakauman samalla tavalla. Kokonaisten kudosleikkeiden skannaus (esim. iho) ja generoimalla massaspektri kullekin yksikköalueelle, tarjotaan kartta yhdisteen kudosjakaumasta.

   MSI voi havaita useita endogeenisiä molekyylilajeja samanaikaisesti, mukaan lukien lipidit, pienet proteiinit sekä eksogeeniset farmaseuttiset lääkkeet, jotka jakautuvat pieninä pitoisuuksina analysoituun kudokseen [8].

   Janfelt ja kollegat [10] pystyivät erottamaan orvaskeden ja dermiksen käyttämällä MSI:tä fosfolipideillä. Käytämme tätä tekniikkaa tunnistaaksemme endogeenisiä kasvainten biomarkkereita, joita esiintyy ihokasvaimissa, mutta joita ei ole (tai eri intensiteetillä) viereisessä normaalissa ihossa. MSI:n integrointi NMSC:n diagnostiseen arsenaaliin käyttämällä tekniikkaa, joka erottaa reaaliaikaisesti pahanlaatuisten ja hyvänlaatuisten kudosten spesifiset kalvolipidimerkit.

   Pitkän aikavälin tavoitteena tämän projektin jälkeen, jos on mahdollista tunnistaa lipidikuviot, jotka pystyvät erottamaan pahanlaatuinen ja terve iho, on ottaa käyttöön Rapid Evaporation Ionization Mass Spectrometry (REIMS), nyt myös nimellä iKnife [11]. Tämä menetelmä voi olla paljon herkempi tunnistamalla suoraan kemialliset kasvaimen allekirjoitukset yksinkertaisen kudoksen anatomian sijaan, ja se on vähemmän työvoimavaltainen ja aikaa vievä. REIMS-tekniikka koostuu massaspektrometriin yhdistetystä sähkökirurgisesta käsikappaleesta, joka pystyy suorittamaan reaaliaikaisen kudoksen tunnistamisen käyttämällä sähkökirurgian aikana tuotettua aerosoloitua kudosta. Kudosten tunnistus saavutetaan automaattisella sovituksella leikkauksen aikana tallennettujen massaspektrien kanssa olemassa olevan "viitekirjaston" kanssa. Modaliteetti antaa kirurgille välitöntä tietoa siitä, minkä tyyppistä kudosta leikataan, ja ohjaa hoitoa rajaamalla syövän rajat hämmästyttävän tarkasti. Lipidomiset profiilit osoittivat vaihtelua histologisten kasvaintyyppien välillä, mikä mahdollisti kudosten erottamisen toimimalla biomarkkereina [12]. REIMS on osoittautunut tehokkaaksi myös muilla aloilla keinona vahvistaa tuotteiden aitoutta ja laatua. Siten elintarviketeollisuudessa REIMS-menetelmää käytetään erottamaan naudan- ja hevosenliha alle 3 sekunnissa, ja sen tarkkuus on 100 % [13].

3. Menetelmä 3.1 Tutkimussuunnitelma potilaille, joilla on BCC ja SCC Kun potilaat lähetetään Mohsin kirurgiseen toimenpiteeseen ihotautien osastolla, Bispebjergin sairaalassa, BCC:t tai SCC:t poistetaan ja kudos upotetaan, leikataan ja värjätään Mohs-kirurgia varten arvioidakseen, onko lisää kudosta on poistettava. Tutkimuksessamme käytetään kolmea ihon osaa (5-10 um paksua) tästä jo poistetusta kudoksesta. Yksi osa HE-värjätään, jotta tiedämme tarkalleen, missä kiinnostavat alueet ovat. MS-analyysiin käytetään kahta osaa (MSI-spektri ja REIMS-spektri).

   Tällä hetkellä teemme Bispebjergin sairaalan ihotautien osastolla Mohs-leikkausta korkean riskin BCC:ille, mutta Mohs Surgery of SCC tulee mukaan vuoden sisällä.

   3.2 Tutkimussuunnitelma potilaille, joilla on aktiiniset keratoosit Kun potilaat lähetetään useiden aktiinisten keratoosien (aste 1, 2 tai 3) hoitoon Bispebjergin sairaalan ihotautien osastolla, otamme ylimääräisen biopsian (2-4 mm) riippuen leesion koosta. Biopsia upotetaan ja leikataan. Käytämme 3 ihoosaa (paksuus 5-10 um). Yksi osa HE-värjätään, jotta tiedämme tarkalleen, missä kiinnostavat alueet ovat. Kahta osiota käytetään Kööpenhaminan yliopiston farmasian laitoksen MS-analyysiin. Mukaan otetaan jopa 100 potilaan aktiiniset keratoosit.

   3.3 Kudosmikrosiru Edellä mainittu MSI-leikkaus antaa tietoa yhdestä kasvaimesta verrattuna viereiseen normaalikudokseen. Meidän on kuitenkin myös verrattava potilaita toisiinsa ja siksi meidän on tehtävä kudosmikrosiru.

   Teemme kudosmikrosirun poistetuista ja upotetuista Aktinisista keratooseista/BCC/SCC-kudoksesta. Yksi leike analysoidaan MSI:llä samalla menetelmällä kuin edellä on kuvattu, ja ylimääräiset leikkeet HE-värjätään patologian arviointia ja perinteisiä immunohistokemiallisia markkereita, kuten Ki67 ja p53, varten.

4. Tilastolliset laskelmat Monimuuttujatilastollinen analyysi suoritetaan kaikille massaspektreille Matlabilla tai vastaavalla ohjelmalla. Lineaarista erotteluanalyysiä käytetään esipahanlaatuisen, syövän ja normaalin kudoksen spektraalisten erojen tunnistamiseen. Luokituksen suorituskyky kirjataan jätä yksi potilas ulos ristiinvalidointijärjestelmällä. Näytteiden määrä perustuu otoskokolaskelmaan ja aikaisempiin muita syöpämuotoja koskeviin julkaisuihin ja sen arvioidaan riittävän referenssikirjaston luomiseen. Suunnittelemme jatkuvan vastemuuttujan tutkimusta vastaavista opiskeluainepareista. Aikaisemmat tiedot osoittavat, että sovittujen parien vasteen ero on normaalisti jakautunut standardipoikkeamalla 8. Jos todettujen parien keskivasteen todellinen ero on 3, meidän on tutkittava 58 koehenkilöparia voidaksemme hylätä nollahypoteesin, jonka mukaan tämä vasteero on nolla todennäköisyydellä (teholla) 0,8. Tämän nollahypoteesin testiin liittyvä tyypin I virhetodennäköisyys on 0,05. (ohjelmoitu näytteen koon laskemiseen; Power and Sample Size Calculation, PS, Vanderbilt University; versio 3.1.2). Näiden laskelmien perusteella rekrytoimme 60-100 potilasta, joilla on BCC, AK ja SCC. Vähimmäismäärä on 180 potilasta ja enintään 300 potilasta.

5. Osallistujat Yhteensä tutkimukseen rekrytoidaan enintään 300 potilasta. Mukana ovat 18-vuotiaat ja sitä vanhemmat miehet ja naiset, jotka täyttävät mukaanotto- ja poissulkemiskriteerit. Kaikki mahdolliset potilaat rekrytoidaan Bispebjergin yliopistollisen sairaalan ihotautiosastolta.

   Kiinnostuneet potilaat kutsutaan alustavalle tietoseulontakäynnille, jossa he saavat kattavaa suullista tietoa tutkimuksesta ensisijaiselta tutkijalta Catharina Lercheltä, Mohs-kirurgilta Martin Gluudilta tai projektihoitaja June Svendseniltä ja jaetaan kirjallista tietoa. Kokous pidetään erillisessä toimistossa turvallisen ja rauhallisen ympäristön varmistamiseksi. Potilaille kerrotaan erityisesti, että he voivat halutessaan tuoda yhden tai useamman arvioijan kaikkiin kokouksiin ja interventioihin. Kirjallinen tietoinen suostumus varmistetaan mukaanoton yhteydessä leikkauspäivänä, joka tapahtuu vähintään 24 tuntia seulontakäynnin jälkeen.

   Tutkija arvioi jokaisen potilaan tutkimukseen osallistumisen soveltuvuuden arvioimiseksi. Optisen vertailun homogeenisen ryhmän varmistamiseksi rekrytointi suoritetaan seuraavien kriteerien mukaisesti:

   5.1 Osallistumiskriteerit • Yli 18-vuotiaat potilaat.

   • Potilaat, joilla on AK:ta, SCC:tä ja BCC:tä.

   • Potilaalta saatu kirjallinen tietoinen suostumus.

   5.2 Poissulkemiskriteerit • Immunosuppressiopotilaat

6. Mahdolliset riskit ja haittavaikutukset Kaikille potilaille tiedotetaan sekä suullisesti että kirjallisesti riskeistä ja mahdollisista sivuvaikutuksista.

   6.1 Punch biopsia Potilaille, joilla on BCC ja SCC, käytämme vain kudosta, joka on jo poistettu tavallisella Mohsin menetelmällä. Potilaille, joilla on aktiininen keratoosi, otetaan biopsia paikallispuudutuksessa, jonka halkaisija on 2, 3 tai 4 mm ja syvyys 3 mm. Jokainen biopsia jättää pyöreän arven, jonka halkaisija on 2 mm tai 4 mm, joka kohoaa 2 viikossa. Paikallispuudutuksen injektio voi aiheuttaa kipua ja pistelyä/pistelyä pistoskohdassa. Tartunnan mahdollisuus on minimaalinen, mutta hoidamme sen, jos se tapahtuu.

7. Biopankki Tutkimusbiopankki perustetaan komitealain §2 nro 2 mukaisesti. 13. Kaikki mahdolliset biopsiat/leikkeet säilytetään lukitussa -80 °C:n pakastimessa Bispebjergin yliopistollisen sairaalan ihotautien osastolla analyysiin asti Kööpenhaminan yliopiston farmasian laitoksella, Universitetsparken 2, 2100 Copenhagen Ø. Emme voi aina tehdä analyysiä 5-7 päivässä, koska yhden MSI-kuvan tekeminen kestää jopa 20 tuntia ja jos meillä on useita BCC/SCC/Aktiinisia keratoosipotilaita yhdessä päivässä, tulee viive. Kudosmikrosirua tehdessämme keräämme kudosta 6-8 potilaasta ennen analysointia. MSI-analyysin jälkeen näytteet tuhotaan. Biopsialohkojen ja kudosmikrosirulohkojen jäljellä olevien osien tuhoutuminen on enintään 1. tammikuuta 2025. Kudoksia ei säilytetä epäspesifistä tutkimusta varten.
8. Potilaslehdistä saadut tiedot Terveydenhuoltohenkilöstö käyttää potilaspäiväkirjasta saatua tietoa epäillyn leesion patologiakuvauksesta, kun se seuloi mahdollisia tähän tutkimukseen sisällytettäviä potilaita. Kun potilas on allekirjoittanut tietoisen suostumuksen, käytetään potilaspäiväkirjassa olevia tietoja kasvaimen tyypin kuvauksesta, sijainnista, koosta ja siitä, onko kyseessä uusiutuva vaurio.

9. Tietosuoja, tiedon tallennus ja laadunvalvonta 9.1 Laadunvalvonta Helsinki II:n julistusta sekä hyvän kliinisen tutkimuksen vaatimuksia noudatetaan. Yksityisyyden kunnioittaminen sekä potilaiden fyysinen ja henkinen koskemattomuus säilytetään. Tutkimus rekisteröidään terveystutkimuksen eettisen komitean ja Tanskan tietosuojaviraston tietoturvakeskuksessa.

   9.2 Tietosuoja ja säilytys Yleistä tietosuoja-asetusta (tanska: Databeskyttelsesloven/Persondataforordningen) noudatetaan. Tanskan pääkaupunkiseudun tietoja käyttävä tutkimus katsotaan julkiseksi tutkimukseksi. Tässä tutkimuksessa kerätyn tiedon käytöstä ja jakelusta keskustellaan potilaiden kanssa suostumusprosessin aikana. Hankkeesta raportoidaan Tanskan Tietosuojan noudattamista käsittelevälle Knowledge Centerille (tanskaksi: Videncenter for Dataanmeldelse, Region Hovedstaden). Laaditaan luettelo seulotuista ja potilaista, mukaan lukien nimet, tutkimuksen tunnusnumero ja syntymäaika. Kaikki kerätyt tiedot anonymisoidaan ja suojataan henkilötietojen hallintaa koskevan Tanskan lain ja Tanskan terveyslain (tanskaksi: Sundhedsloven) mukaisesti. Tiedot rekisteröidään ja säilytetään 5 vuoden ajan tutkimuksen päätyttyä Bispebjergin sairaalan ihotautiosastolla.

10. Taloudelliset näkökohdat Tutkimuksen on suunnitellut periaatetutkija Catharina M. Lerche. Kaupalliset yritykset eivät ole saaneet taloudellista tukea. Bispebjergin yliopistollisen sairaalan ihotautiosasto maksaa johtajatutkija Catharina M Lerchelle palkan. Muut hankkeeseen liittyvät kulut rahoittavat Tanskan syöpäyhdistys (Knæk Cancer midler 1,6 milj. DKK) ja Lundbeck Foundation (10 milj. DKK). Päätutkija Catharina M. Lerche ja yhteistyökumppanit eivät ole henkilökohtaisia ​​tai taloudellisia sidoksia Tanskan syöpäyhdistykseen tai Lundbeck-säätiöön.
11. Korvaukset Potilaille ei makseta korvauksia.

12. Tietoa potilaille Ensisijainen tutkija Catharina M. Lerche on vastuussa selkeiden suullisten ja kirjallisten tietojen antamisesta tutkimuksen tavoitteesta, suunnittelusta ja riskeistä, kuten Tanskan terveysministeriön asiakirjassa "Information og samtykke til deltagelse I sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter" todetaan. tanska: Sundheds- og Ældreministeriet). Häiriöttömässä ympäristössä osallistujalle kerrotaan hänen oikeudestaan ​​olla läsnä/tai useampi arvioija, kyseinen osallistuja on vapaaehtoinen ja että hän voi vetäytyä milloin tahansa tutkimuksen aikana. Potilaille annetaan riittävä harkinta-aika (vähintään 24 tuntia). Potilaita pyydetään allekirjoittamaan suostumuslomake.

    Potilasta kehotetaan lukemaan oheinen materiaali tutkimukseen osallistujan oikealta puolelta. Tutkimustoimenpiteitä ei aloiteta ennen kuin osallistujat ovat allekirjoittaneet tietoisen suostumuksen. Potilaiden lisäkysymyksiin vastaa yhteyshenkilö Catharina M. Lerche

13. Tulosten julkaiseminen Positiiviset, negatiiviset ja epäselvät tulokset julkaistaan. Tavoitteena on julkaista ja esitellä tuloksia kansainvälisessä vertaisarvioidussa dermatologisessa lehdessä ja/tai dermatologisissa konferensseissa. Tulosten immateriaalioikeudet kuuluvat Bispebjergin yliopistolliseen sairaalaan. Julkaisut ovat Vancouverin ohjeiden mukaisia.
14. Etiikka Biopsiat otetaan Bispebjergin yliopistollisen sairaalan ihotautiosastolla. Henkilötietoja ja näytteitä käsitellään henkilötieto- ja terveyslain mukaisesti. Lisäksi hanke toteutetaan niin, että osallistujien terveys- ja turvallisuusriskit ovat mahdollisimman vähäiset.

Kirurgiset toimenpiteet ovat päivittäisiä tapahtumia sairaaloissa ja klinikoilla kaikkialla maailmassa. Tällä NMSC-biomarkkereiden tutkimuksella ja uuden ihosyövän massaspektrometriaan perustuvan hoidon kehittämisellä on potentiaalia vähentää kasvaimen uusiutumista, sairastuvuutta ja kustannuksia. Tutkimusta NMSC-biomarkkereista ja REIMS:n kliinisestä toteutuksesta ihosyövän hoidossa ei ole vielä tehty. Tämän tutkimuksen mahdollisten haittavaikutusten riskien odotetaan olevan pienet ja että kasvaimen uusiutumisen, sairastuvuuden, kustannusten paranemisen, vähemmän työvoimavaltaisen ja aikaa vievän hyödyn on mahdollista saada. Todisteisiin perustuvien tulevien hyötyjen ja tämän tutkimuksen tarjoamien tulevaisuudennäkymien potentiaalia tulisi torjua osallistujien epämukavuuden tunnetta koepalan ja ylimääräisen Bispebjergin sairaalan aikana. Potilaiden oikeuksia ja korvauksia koskevia Tanskan lakeja noudatetaan.

15. Vakuutus Bispebjergin sairaala

16. Viitteet

1. Ruokavalio, ravitsemus, fyysinen aktiivisuus ja ihosyöpä. 2018
2. Lamberg, A. L. et ai. Tanskalainen nonmelanooma-ihosyöpädermatologiatietokanta. Clin. Epidemiol. 8, 633-636 (2016).
3. Jensen, A. et ai. Alkoholin nauttiminen voi muuttaa ei-melanooma-ihosyövän riskiä: Tulokset suuresta tanskalaisesta tulevasta kohorttitutkimuksesta. J. Invest. Dermatol. 132, 2718-2726 (2012).
4. Kyrgidis, A., Tzellos, T. G., Vahtsevanos, K. & Triaridis, S. New Concepts for Basal Cell Carcinoma. Demografiset, kliiniset, histologiset riskitekijät ja biomarkkerit. Systemaattinen katsaus todisteisiin, jotka koskevat kasvaimen kehittymisen riskiä, ​​alttiutta toiselle ensisijalle ja uusiutumiselle. J. Surg. Res. 159, 545-556 (2010).
5. Bentzen, J. et ai. Melanooman ja ei-melanooman ihosyövän sairauden kustannukset Tanskassa. euroa J. Cancer Ed. 22, 569-576 (2013).
6. Smeets, N. W. J. et ai. Mohsin mikrografinen leikkaus kasvojen tyvisolusyövän hoitoon - Retrospektiivisen tutkimuksen tulokset ja kirjallisuuskatsaus. Br. J. Dermatol. 151, 141-147 (2004).

8. Nilsson, A. et ai. Massaspektrometriakuvaus lääkekehityksessä. Anaali. Chem. 87, 1437-1455 (2015).

10. Sørensen, I. S. et ai. MALDI-MSI:n ja kasettiannostelun yhdistelmä lääkkeiden jakautumisen arvioimiseksi ihmisen ihon eksplantissa. Anaali. Bioanal. Chem. 409, 4993-5005 (2017).

11. Balog, J. et ai. Biologisten kudosten tunnistaminen nopealla haihdutusionisaatiomassaspektrometrialla. Anaali. Chem. 82, 7343-7350 (2010).

12. Balog, J. et ai. Intraoperatiivinen kudostunnistus nopealla haihtumisionisaatiomassaspektrometrialla. Sci. Käännös Med. 5, (2013).

13. Balog, J. et ai. Lihatuotteiden alkuperälajin tunnistaminen nopealla haihtumisionisaatiomassaspektrometrialla. J. Agric. Food Chem. 64, 4793-4800 (2016).