インプラント手術中に採取される自家粒子

収集された骨の量が分析されたら、残りの研究変数には 100 mg の骨が使用されます。

骨サンプルは 37% リン酸ゲルに 15 秒間埋め込まれ、その後、大量の水で洗浄されて残りの酸が除去されます。 続いて、サンプルは炭素コーティングを施した後、走査型電子顕微鏡で検査するためにホルダーに取り付けられます。

サンプルを 100 倍で視覚化した後、画像解析ソフトウェア ImageJ を使用した解析のためにデジタル画像が撮影されます。

最後に、カルシウムとリンのレベルは、Inca Microanalysis Systems ソフトウェアを使用して分析されます。

サイズはnmで表します。

2 つの比較プロトコルのうちの 1 つを使用して、100 mg の収集骨を含む滅菌エッペンドルフ チューブを 217 g で 6 分間遠心分離します。 上清を収集し、ELISA キットを使用して BMP-2 と VEGF を定量するために使用します。 この手順は、製造元が提供するプロトコルに従って実行されます。 405 nmでの吸光度は、EXL-800タイプのELISAリーダーを使用して測定されます。

変数は 100mg あたりの % で表されます。

粉砕シーケンス中に収集された骨内の骨芽細胞の形態と骨芽細胞の数を 2 つの比較プロトコルと比較するために、100 mg の骨を直ちにウシ胎児血清と 1% 抗生物質 (ペニシリン 10,000 U/ml) を添加した α-MEM で培養します。およびストレプトマイシン 10,000 μg/ml) 培地は 3 日ごとに交換します。

培養した骨芽細胞の形態と数を7日目と14日目に観察します。 40 倍の光学顕微鏡で視覚化した後、形態は正常または異常として説明されます。

変数は 100mg あたりの % で表されます。

粉砕シーケンス中に骨を収集した後の骨芽細胞の細胞培養における沈降カルシウム小結節の存在の可能性を 2 つの比較プロトコルと比較するために、培養骨芽細胞の 4 継代 (培養 21 日目) を使用します。 細胞をＰＢＳで洗浄し、７５％冷エタノールで１時間固定し、ｐＨ８．３の０．１％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｑｕｉｍｉｃａ Ｓ．Ａ．、スペイン、マドリッド）１ｍｌとともに１０分間インキュベートする。 そして、沈降したカルシウム結節があれば赤く染色され、光学顕微鏡で観察されます。 最後に、20% メタノールと 10% 酢酸の溶液を 10 分間使用して、アリザリン レッドを溶解します。 結果は、EXL-800 タイプ ELISA リーダーを使用して 550 nm での吸光度を測定することによって定性的に表されます。

変数は%で表されます

また、培養骨芽細胞の 4 継代 (培養 21 日目) も使用します。 細胞は、ウェルあたり 1 X 103 細胞の密度で 96 ウェル培養プレートに播種されます。 細胞増殖は、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2H-臭化テトラゾリウム (MTT) アッセイを使用して、インキュベーションの 2、6、および 12 日目に評価されます。 まず、20 μl の MTT (Sigma-Aldrich Quimica S.A.、マドリード、スペイン) を培地に添加し、4 時間インキュベートします。 次に、培地を除去し、150 μl のジメチルスルホキシド (Sigma-Aldrich Quimica S.A.、マドリード、スペイン) を各ウェルに加えます。 結果は、490 nm での吸光度を測定することによって分析されます。

変数は%で表されます

細胞周期の研究には、4 継代培養骨芽細胞 (培養 21 日目) も使用します。 0.05% トリプシン (Sigma-Aldrich Quimica S.A.、マドリッド、スペイン) および 0.02% EDTA を使用して細胞培養フラスコから細胞を剥がします。 その後、細胞周期分析のために洗浄され、PBS に懸濁されます。 細胞を、100 mlのRNase (1 mg/ml)および100 mlのヨウ化プロピジウムとともに37℃で30分間インキュベートします。

染色された細胞の DNA 含有量は、488 nm アルゴン レーザーを備えた FACSCaliburTM フローサイトメーターを使用して研究され、2000 件のイベントから前方散乱 (FSC)、側方散乱 (SSC)、およびヨウ化プロピジウム蛍光強度 (PLA-2) データが収集されます。 データは CELLQUEST ソフトウェアと MODFIT プログラムを使用して分析され、G0/G1、G2/M、および S 期の細胞の割合が決定されます。

変数は%で表されます

細胞遊走能力の研究には、培養骨芽細胞の 4 継代 (培養 21 日目) も使用します。 細胞を6ウェル培養プレートにウェル当たり5×104細胞の密度で播種し、100%コンフルエンスに達するまで24時間インキュベートします。 続いて、滅菌 300 μl ピペットチップを使用して各ウェルに 3 本の平行線を引いて空の細胞スペースを作成し、6、12、および 24 時間で細胞遊走を観察します。

細胞遊走は、MIP-4.5画像解析システムを使用して決定されます。 6、12、24 時間後の各ウェルのデジタル画像を使用して、空の細胞スペースの分離/接近の 10 ラインが測定され、細胞が移動した距離が次の式を使用して計算されます: 移動距離 = (A0/ 2) - (At/2)。ここで、A0 は無細胞空間の初期幅、At は 6、12、または 24 時間後の無細胞空間の幅です。

変数は%で表されます

骨芽細胞の細胞生存率は14日目に調査されます。 0.05% トリプシン (Sigma-Aldrich Quimica S.A.、マドリッド、スペイン) を使用して細胞を細胞培養フラスコから分離し、ノイバウアー チャンバーを使用して定量します。 次に、細胞をトリパンブルーで染色して細胞生存率を決定します。

変数は 100mg あたりの % で表されます。