Recolección de partículas autógenas durante la cirugía de implantes

Una vez analizada la cantidad de hueso recolectado, se utilizarán 100 mg de hueso para el resto de variables del estudio.

Las muestras de hueso se incrustarán en un gel de ácido fosfórico al 37% durante 15 segundos y luego se lavarán con abundante agua para eliminar el ácido restante. Posteriormente, las muestras se montarán en soportes para examinarlas bajo el microscopio electrónico de barrido después de recibir una capa de carbono.

Después de visualizar las muestras a 100X, se tomarán imágenes digitales para su análisis utilizando el software de análisis de imágenes ImageJ.

Finalmente se analizarán los niveles de calcio y fósforo mediante el software Inca Microanalysis Systems.

El tamaño se expresará en nm.

Los tubos Eppendorf estériles que contienen 100 mg de hueso recogido con uno de los dos protocolos comparados se centrifugarán a 217 g durante 6 minutos. El sobrenadante se recolectará y se utilizará para cuantificar BMP-2 y VEGF utilizando un kit ELISA. El procedimiento se realizará siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La absorbancia a 405 nm se medirá utilizando un lector ELISA tipo EXL-800.

La variable se expresará en % por 100 mg.

Para comparar la morfología y el número de osteoblastos en el hueso recolectado durante la secuencia de fresado con los dos protocolos comparados, los 100 mg de hueso se cultivarán inmediatamente en α-MEM suplementado con suero fetal bovino y antibiótico al 1% (penicilina 10.000 U/ml). y estreptomicina 10.000 µg/ml) El medio de cultivo se cambiará cada 3 días.

La morfología y número de osteoblastos cultivados se observarán a los 7 y 14 días. Después de la visualización bajo un microscopio óptico de 40X, la morfología se describirá como normal o anormal.

La variable se expresará en % por 100 mg.

Para comparar la posible presencia de nódulos de calcio precipitados en el cultivo celular de osteoblastos después de recolectar hueso durante la secuencia de fresado con los dos protocolos comparados, utilizaremos el cuarto pase de osteoblastos cultivados (a los 21 días de cultivo). Las células se lavarán con PBS, se fijarán con etanol frío al 75% durante 1 hora y se incubarán con 1 ml de rojo de alizarina al 0,1% a pH 8,3 (Sigma-Aldrich Química S.A., Madrid, España) durante 10 minutos. Luego, si hay nódulos de calcio precipitados, se teñirán de rojo y se observarán al microscopio óptico. Finalmente utilizaremos una solución de 20% de metanol y 10% de ácido acético durante 10 minutos para disolver el rojo de alizarina. Los resultados se expresarán cualitativamente midiendo la absorbancia a 550 nm utilizando un lector ELISA tipo EXL-800.

La variable se expresará en %

También utilizaremos el cuarto pase de osteoblastos cultivados (a los 21 días de cultivo). Las células se sembrarán en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 1 X 103 células por pocillo. La proliferación celular se evaluará a los 2, 6 y 12 días de incubación utilizando el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT). Primero, se agregarán al medio 20 µl de MTT (Sigma-Aldrich Química S.A., Madrid, España) y se incubarán durante 4 horas. Posteriormente, retiraremos el medio y añadiremos a cada pocillo 150 µl de dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich Química S.A., Madrid, España). Los resultados se analizarán midiendo la absorbancia a 490 nm.

La variable se expresará en %

Para el estudio del ciclo celular utilizaremos también el cuarto pase de osteoblastos cultivados (a los 21 días de cultivo). Las células se separarán de los matraces de cultivo celular utilizando tripsina al 0,05% (Sigma-Aldrich Química S.A., Madrid, España) y EDTA al 0,02%. Posteriormente, se lavarán y suspenderán en PBS para el análisis del ciclo celular. Las células se incubarán a 37º C durante 30 minutos con 100 ml de RNasa (1 mg/ml) y 100 ml de yoduro de propidio.

El contenido de ADN de las células teñidas se estudiará utilizando un citómetro de flujo FACSCaliburTM con un láser de argón de 488 nm para recopilar datos de dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) e intensidad de fluorescencia de yoduro de propidio (PLA-2) de 2000 eventos. Los datos serán analizados mediante el software CELLQUEST y el programa MODFIT, determinando el porcentaje de células en las fases G0/G1, G2/M y S.

La variable se expresará en %

Para el estudio de la capacidad de migración celular también utilizaremos el cuarto pase de osteoblastos cultivados (a los 21 días de cultivo). Las células se sembrarán en placas de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 5 X 104 células por pocillo y se incubarán durante 24 horas hasta alcanzar el 100% de confluencia. Posteriormente, se dibujarán 3 líneas paralelas en cada pocillo utilizando una punta de pipeta estéril de 300 µl para crear espacios celulares vacíos y se observará la migración celular a las 6, 12 y 24 horas.

La migración celular se determinará utilizando el sistema de análisis de imágenes MIP-4.5. Utilizando imágenes digitales de cada pocillo a las 6, 12 y 24 horas, se medirán 10 líneas de separación/aproximación de los espacios vacíos de las celdas y se calculará la distancia recorrida por las celdas mediante la fórmula: distancia de migración = (A0/ 2) - (At/2), donde A0 es el ancho inicial del espacio libre de células y At es el ancho del espacio libre de células a las 6, 12 o 24 horas.

La variable se expresará en %

Las proporciones de viabilidad celular de los osteoblastos se estudiarán el día 14. Las células se separarán de los matraces de cultivo celular utilizando tripsina al 0,05% (Sigma-Aldrich Química S.A., Madrid, España) y se cuantificarán utilizando una cámara de Neubauer. Luego, las células se teñirán con azul tripán para determinar los índices de viabilidad celular.

La variable se expresará en % por 100 mg.